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Apr 29, 2023

Ein Versuchsplanungsbildschirm zeigt, dass Clostridium novyi

Band Kommunikationsbiologie

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 118 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Obwohl Clostridium novyi-NT ein bakterielles Antikrebstherapeutikum ist, das in hypoxischen Tumoren keimt, um Krebszellen abzutöten, sind die tatsächlichen Keimungsauslöser für C. novyi-NT noch unbekannt. In dieser Studie untersuchen wir mögliche Keimstoffe mithilfe kombinatorischer Versuchspläne und entdecken durch Zufall, dass D-Valin ein wirksamer Keimstoff ist, der bei einer Konzentration von 4,2 mM eine Sporenkeimung von 50 % induziert. Weitere Untersuchungen ergaben, dass fünf D-Valin-Analoga ebenfalls Keimstoffe sind und vier dieser Analoga Enantiomerenpaare sind. Dieser stereoflexible Effekt von L- und D-Aminosäuren zeigt, dass die Sporenkeimung ein komplexer Prozess ist, bei dem enantiomere Wechselwirkungen störend sein können. Diese Studie identifiziert auch L-Cystein als Keimmittel und Hypoxanthin und Inosin als Co-Keimmittel. Mehrere andere Aminosäuren fördern (L-Valin, L-Histidin, L-Threonin und L-Alanin) oder hemmen (L-Arginin, L-Glycin, L-Lysin, L-Tryptophan) die Keimung auf interaktionsabhängige Weise. D-Alanin hemmt jegliche Keimung, selbst in komplexen Wachstumsmedien. Diese Arbeit legt den Grundstein für die Verbesserung der Keimungseffizienz von C. novyi-NT-Sporen in Tumoren.

Clostridium novyi Typ A ist ein obligat anaerobes, sporenbildendes Bakterium, das bei Schafen, Ziegen und Schweinen clostridiale Myonekrose, Großkopf- und nekrotische Hepatitis verursacht1. Insbesondere ist es für den „Dikkop“-Schwellkopf bei Widdern verantwortlich, einer Infektion, die durch Wunden zwischen jungen Widdern im Kampf auftritt und innerhalb von 48–72 Stunden zum Tod führt. C. novyi ist bei Rindern eher ein Krankheitserreger als bei Menschen, mit Ausnahme eines sporadischen Ausbruchs von Infektionen bei Drogenkonsumenten in Schottland, deren Heroin durch C. novyi-Sporen kontaminiert war3.

C. novyi-NT, eine nicht-tödliche Version des Wildtyp-Bakteriums, das durch Abschwächung seines Alpha-Toxins entsteht, befindet sich derzeit in der klinischen Erprobung als experimentelles Therapeutikum für solide Tumoren4,5. Das therapeutische Potenzial von C. novyi-NT beruht auf seiner Fähigkeit, die hypoxischen Regionen (<0,5 % Sauerstoff) von Tumoren selektiv zu besiedeln und eine lokalisierte zytotoxische Wirkung auszuüben6. Obwohl andere Clostridien vor C. novyi-NT auf ihre tumortötende Wirkung untersucht wurden, war C. novyi-NT der erste, der als Sporen statt als vegetative Stäbchen verabreicht wurde4. Abgesehen davon, dass es relativ nicht immunogen ist, fügt die Verabreichung von C. novyi-NT als Sporen eine zusätzliche Ebene der Tumorspezifität hinzu, da die Keimung innerhalb der hypoxischen Tumormikroumgebung begünstigt wird4,6. Da die Sporen ruhen, sind sie auch resistent gegen den Sauerstoff, der sie sonst in ihrer vegetativen Form abtöten würde6. Obwohl Sporen daher die ideale Clostridienform für die Tumortherapie sind, ist außer der Notwendigkeit einer reduzierenden Umgebung wenig darüber bekannt, was eine C. novyi-NT-Spore zum Keimen bringt. Darüber hinaus bleibt es ein Rätsel, was C. novyi-NT zu einem wirksamen Kolonisator für einige Tumoren macht, für andere jedoch nicht.

Unser aktuelles Wissen über Bakteriensporen und -keimung basiert weitgehend auf den Gattungen Bacillus und Clostridium8,9. Im Wesentlichen sporulieren Bakterien, wenn die Stoffwechselressourcen knapp sind, keimen jedoch, wenn wieder ressourcenreiche Bedingungen vorherrschen. Die Fähigkeit, in einem Ruhezustand geduldig auf die Rückkehr günstiger Bedingungen zu warten, verdeutlicht den Überlebensvorteil sporulierender Bakterien. Bei pathogenen Bakterien treibt dieser zyklische Prozess die Pathogenese voran, da einst harmlose Sporen ihre Zielumgebung infizieren und in ihre toxinproduzierenden vegetativen Formen keimen10,11,12. Die Keimung kann in zwei Phasen unterteilt werden13. Die erste Stufe beginnt mit der Interaktion niedermolekularer Nährstoffkeimstoffe mit spezifischen Proteinen, die als Keimungsrezeptoren (GRs) bezeichnet werden. Die GR-Aktivierung führt zur Freisetzung einwertiger Kationen (H+, K+ und Na+) und Calciumdipicolinat (CaDPA) sowie zur teilweisen Hydratisierung des Sporenkerns. Im zweiten Stadium wird die Sporenrindenschicht hydrolysiert, was zur Kernausdehnung und vollständigen Hydratation führt und den Übergang aus der Ruhephase abschließt. Anschließend werden DNA, Proteinsynthese und wichtige Stoffwechselwege aktiv, was zum Wachstum der vegetativen Form führt14.

Es ist bekannt, dass Bakteriensporen als Reaktion auf eine Vielzahl von Faktoren wie Aminosäuren15, Purine16, Zucker17, Gallensalze18 und Ionen19 keimen. Keimstoffe sind wichtige Korrelate nährstoffreicher Umgebungen, und sporulierende Bakterien haben sich daher so entwickelt, dass sie sie als Signale zum Verlassen der Sporenruhe nutzen. Das Screening auf Keimorganismen erfolgt in der Regel durch den Nachweis der Sporenkeimung, die durch einen Abfall der optischen Dichte oder Brechkraft signalisiert wird, in Gegenwart einzelner Keimorganismen. Tatsächliche Keimungsumgebungen sind jedoch komplex und enthalten zahlreiche Faktoren, die die Wirkung eines mutmaßlichen Keimmittels verstärken oder antagonisieren können. Beispielsweise keimen Clostridioides difficile-Sporen in Gegenwart des Gallensalzes Taurocholat. In der Darmumgebung kann diese Keimung jedoch durch andere von Mikroben stammende sekundäre Gallensalze wie Lithocholat und Ursodeoxycholat antagonisiert werden20. Im umgekehrten Szenario könnten mutmaßliche Keimstoffe, die positive Wechselwirkungen mit anderen Faktoren in der Umgebung erfordern, ein falsch negatives Ergebnis liefern, wenn sie als einzelner Kandidat bewertet werden.

Das Screening der einzelnen Keimpflanzenkandidaten ergibt immer ein unvollständiges Bild, wenn Wechselwirkungen zwischen ihnen bestehen. Daher ist ein Ansatz erforderlich, der nach Keimungsfaktoren in Kombinationen sucht, da die traditionelle Intuition, jeweils nur einen Faktor zu ändern, mit zunehmender Anzahl von Variablen exponentiell ineffizient wird. Bei einem Design of Experiments (DOE)-Ansatz werden mehrere Faktoren gleichzeitig auf strukturierte Weise verändert21. Im Bereich der Sporenbiologie wurde DOE zur Optimierung von Medienkomponenten für die bakterielle Sporulation22,23,24 und Kultivierung25,26,27 eingesetzt. In dieser Studie verwenden wir DOE, um Keimungsfaktoren mit den bedeutendsten Auswirkungen sowie Wechselwirkungen zwischen ihnen zu identifizieren. Diese Experimente enthüllten keimende und kokeimende Kandidaten und führten außerdem zu der zufälligen Beobachtung von D-Valin und seinen Analoga als wirksame Keimmittel von C. novyi-NT.

Ergänzungstabelle 1 ist ein Beispiel für ein DOE-Design, bei dem Zeilen unabhängige Experimente und Spalten getestete Faktoren darstellen. Jede Zeile testet eine andere Kombination getesteter Faktoren, die entweder vorhanden (+) oder nicht vorhanden (−) sind. Jede Spalte hat die gleiche Anzahl an +- und −-Ebenen, und zwei zufällig ausgewählte, nebeneinander platzierte Spalten haben die gleiche Anzahl an gepaarten Ebenen (++, +−, −+ und −−). Daher ist jede Stufe (+ oder −) jedes Faktors gleich oft mit jeder Stufe (+ oder −) jedes anderen Faktors verknüpft. Die +- und −-Werte jedes Faktors können somit direkt miteinander verglichen werden, da beide genau dem gleichen ausgewogenen Hintergrund der anderen Faktoren unterliegen. Auf diese Weise eingesetzt, schätzen DOE-Screenings mithilfe einer effizienten Anzahl experimenteller Durchläufe die signifikantesten Faktoren aus einer Vielzahl von Kandidatenfaktoren ab.

Wir haben die Keimungsanforderungen für C. novyi-NT auf drei Arten charakterisiert, indem wir nach primären Keimmitteln, Mitkeimmitteln und Wechselwirkungen zwischen identifizierten Kandidaten gesucht haben (Abb. 1a). Das Plackett-Burman (PB)-Design (Ergänzungstabelle 1) wurde in ersten Experimenten verwendet, bei denen die Anzahl der zu testenden Faktoren hoch war (>5). Nachdem diese Zahl auf die wichtigsten Keimungsförderer gefiltert wurde, wurde ein vollständiges faktorielles Design (Ergänzungstabelle 2) verwendet, um etwaige Wechselwirkungen zwischen ihnen zu analysieren. In allen Experimenten wurde die Keimung anhand des Abfalls der OD600 im Laufe der Zeit gemessen. Alle positiven Keimungswerte wurden durch Verlust der Brechkraft unter Phasenkontrastmikroskopie verifiziert. Bei den Keimtests wurden zunächst hohe unphysiologische Konzentrationen verwendet, um falsch negative Ergebnisse zu minimieren. Anschließend wurden Dosis-Wirkungs-Studien verwendet, um die gescreenten Keimstoffe in physiologischen Konzentrationen zu untersuchen. In dieser Studie sind alle Keimkandidaten in der Ergänzungstabelle 3 katalogisiert, die in den DOE-Diagrammen verwendeten technischen Begriffe sind in der Ergänzungstabelle 4 definiert und alle durchgeführten statistischen Tests sind in der Ergänzungstabelle 5 aufgeführt.

ein Schema des Design of Experiments (DOE)-Ansatzes. b 20 L-Aminosäuren in den Konzentrationen in der Ergänzungstabelle 3 wurden in verschiedenen Kombinationen gemäß dem Plackett-Burman (PB)-Design in der Ergänzungstabelle 1 hinzugefügt. Die Abbildung zeigt die verschiedenen Kombinationen, sortiert in absteigender Reihenfolge (von oben nach unten) der Keimungsreaktion ausgedrückt als ΔOD (äußerste rechte Spalte), wie in der Ergänzungstabelle 4 definiert. Die Abbildung zeigt auch die Wirkung (untere Reihe) jeder L-Aminosäure auf die ΔOD, angeordnet in aufsteigender Reihenfolge von links nach rechts. Die rot und grün hervorgehobenen Faktoren an den beiden äußersten Enden der Matrix stellen die L-Aminosäuren mit den signifikantesten antagonistischen bzw. keimfördernden Wirkungen dar (ɑ = 0,0005). Alle Daten wurden aus zwei unabhängigen Experimenten mit jeweils zwei Wiederholungen gemittelt und stellen mittlere Antwortwerte dar. c 20 L-Aminosäuren in der doppelten Konzentration in der Ergänzungstabelle 3 wurden einzeln pro Vertiefung zugegeben. Dargestellt ist das Streupunktdiagramm des Keimausmaßes für 20 L-Aminosäuren als Einzelfaktoren (Mittelwert ± SD), n = 4 biologisch unabhängige Proben. Die gestrichelte Linie stellt die 10 %-Schwelle für die Keimung dar. L-Aminosäuren werden nach ihrem Keimungsgrad (wie in der Ergänzungstabelle 4 definiert) sortiert, vom höchsten zum niedrigsten Wert von links nach rechts. Der violett schattierte Bereich hebt L-Aminosäuren hervor, die im Vergleich zu L-Valin eine signifikante Keimung zeigen (ungepaarter t-Test, ****p < 0,0001). d Venn-Diagramm bedeutender keimungsfördernder Kandidaten, die durch das PB-Screening (grün) und das Einzelfaktor-Screening (lila) entdeckt wurden.

L-Aminosäuren signalisieren das Vorhandensein von Nährstoffen und sind die häufigsten Keimstoffe für Bakteriensporen. Wir haben die 20 kanonischen L-Aminosäuren (Ergänzungstabelle 3) genommen und sie mithilfe zweier paralleler Ansätze auf Keimeigenschaften getestet. Im ersten Schritt testeten wir Kombinationen von L-Aminosäuren mithilfe eines speziellen DOE-Ansatzes namens Plackett-Burman (PB)-Design28. Im zweiten Schritt haben wir wie üblich jede L-Aminosäure einzeln getestet.

Warum PB neben einem normalen Keimschutz durchführen? Erstens würde ein PB-Screening nicht nur Keimlinge, sondern auch Keimungsantagonisten identifizieren. Der zweite Grund hat mit Interaktionen zu tun. PB, das von Natur aus auf Kombinationen von Faktoren basiert, führt zu abweichenden Ergebnissen mit dem Einzelfaktor-Screening, wenn Wechselwirkungen zwischen Faktoren bestehen. Dies stellt eine Einschränkung von PB dar, wenn es für das primäre Ziel des Screenings auf unabhängige Faktoren verwendet wird. Hier nutzen wir diese Eigenschaft bewusst, um die Existenz von Wechselwirkungen zwischen den L-Aminosäuren aufzudecken. Schließlich ist es denkbar, dass es Wechselwirkungen gibt, die dazu führen, dass eine keimende L-Aminosäure in Gegenwart einer anderen L-Aminosäure mehr oder weniger wirksam wird. Wenn umgekehrt keine Interaktionen vorhanden wären, sollten beide Bildschirme identische Ergebnisse liefern.

Für das PB-Screening wurden 24 Kombinationen der 20 kanonischen L-Aminosäuren konstruiert, sodass jede Aminosäure in der Hälfte der Kombinationen vorhanden war und in der anderen Hälfte fehlte (Ergänzungstabelle 1). Bei einem PB-Design muss nur ein Bruchteil aller möglichen 220 Permutationen von L-Aminosäuren getestet werden, sodass ein einziges PB-Experiment mit kinetischen OD600-Messungen in einer einzigen Mikrotiterplatte durchgeführt werden kann, wobei jede Vertiefung einer Kombination entspricht. Es wurden zwei PB-Experimente (jeweils mit zwei Wiederholungen pro Kombination) durchgeführt, und die normale Darstellung der standardisierten Effekte ist in der ergänzenden Abbildung S1 dargestellt. Darüber hinaus ist in Abb. 1b eine intuitivere Datendarstellung der ΔOD für jede Kombination und der mit jeder L-Aminosäure verbundenen Wirkung dargestellt. In den Spalten sind die Kandidaten für die Keimung nach der Reihenfolge ihrer zugehörigen Auswirkung auf die Keimung aufgeführt, während in den Zeilen die Kombinationen dieser Kandidaten nach der Reihenfolge der Keimungsreaktion geordnet sind. In dieser Studie verwenden wir den Begriff „Pro-Keimungsmittel“ oder „Pro-Keimungsfaktor“, um sich auf einen Faktor zu beziehen, der die Keimung fördert, unabhängig davon, ob er unabhängig (z. B. als primäres Keimmittel) oder in Kombination (z. B. als) wirkt ein Mitkeimer). Entlang der Säulen sind vier keimungsfördernde Faktoren (L-Valin, L-Cystein, L-Histidin und L-Threonin) sowie vier keimhemmende Faktoren (L-Arginin, L-Glycin, L-Lysin und L- Tryptophan) wurden als signifikante Effekte identifiziert (99,95 KI, Modellanpassung R2 = 92,1 %). Da es sich bei den Reihen um Kombinationen handelt und diese in ähnlicher Weise nach der Keimungsreaktion geordnet sind, würde man erwarten, dass die Reihe, die jeden einzelnen Keimkandidaten enthält, ganz oben oder fast ganz oben platziert wäre, wenn es keine Wechselwirkungen gäbe. Stattdessen sehen wir, dass sich die Zeile mit allen Kandidaten in Zeile 11 von 24 befindet. Wenn wir diese Zeile als visuelle Referenz verwenden, werden die keimfördernden Faktoren über Zeile 11 oben rechts angereichert. Umgekehrt sind die Antikeimfaktoren unterhalb der Zeile 11 unten links angereichert. Dies steht im Einklang mit unserer Intuition, dass das Abziehen der keimhemmenden Faktoren aus Zeile 11 die Keimungsreaktion erhöhen sollte und diese Kombinationen über Zeile 11 eingestuft werden sollten. Andererseits hätte das Abziehen der keimungsfördernden Faktoren aus Zeile 11 den gegenteiligen Effekt Dies verringert die Keimungsreaktion, und diese Kombinationen würden unter Zeile 11 eingestuft. Diese Ergebnisse zeigen, dass wir wichtige Informationen verpassen, indem wir Wechselwirkungen nicht berücksichtigen. Parallel zum PB-Screening wurde ein Einzelfaktor-Screening durchgeführt, bei dem jede der 20 L-Aminosäuren unabhängig voneinander als Keimkandidaten bewertet wurde (Abb. 1c). Hier induzierten L-Cystein und L-Alanin signifikant eine Keimung von mehr als 10 % und wurden als Keimstoffe identifiziert.

Zusammengenommen zeigen sowohl die PB- als auch die Einzelfaktor-Ergebnisse, dass Wechselwirkungen tatsächlich die Aktivität von Keimungsfaktoren auf eine Weise modulieren, die sich in einem typischen Einzelfaktor-Keimungsscreening nicht widerspiegelt (Abb. 1d). L-Cystein war das einzige Keimmittel, das in beiden Screens identifiziert wurde, was zeigt, dass seine Keimfähigkeit auch dann wirksam war, wenn es mit anderen Aminosäuren vermischt wurde. Die verbleibenden Keimlinge wurden entweder im PB- oder Einzelfaktor-Screening allein identifiziert. L-Alanin beispielsweise wurde nur im Einzelfaktor-Screening identifiziert, was darauf hindeutet, dass seine Keimfähigkeit als Einzelwirkstoff durch hemmende Wechselwirkungen mit anderen Aminosäuren maskiert wurde. Schließlich wurden L-Valin, L-Histidin und L-Threonin allein im PB-Screen als Keimstoffe identifiziert. Dies zeigt, dass bestimmte L-Aminosäuren, obwohl sie für sich genommen inert sind, wahrscheinlich die Keimung in Gegenwart anderer Faktoren in der Umwelt fördern können.

Als nächstes untersuchten wir die Wechselwirkungen zwischen den 5 L-Aminosäuren (Abb. 1d), die sich positiv auf die Keimung auswirken, indem wir alle 25 Kombinationen dieser Keimstoffe auf Wechselwirkungen zwischen ihnen testeten (Abb. 2a und Ergänzungstabelle 2). Ähnlich wie in Abb. 1b zeigen die Spalten in Abb. 2a die Keimförderer, sortiert nach ihrer Wirkung auf die Keimung, und die Zeilen zeigen Kombinationen dieser Keimförderer, sortiert nach der Keimungsreaktion. In diesen Ergebnissen belegt L-Cystein die obersten Reihen und fehlt in den unteren Reihen. Kurz gesagt, eine hohe Keimungsreaktion wird nur erreicht, wenn L-Cystein vorhanden ist. Die Dominanz von L-Cystein als Pro-Keimungsmittel im Vergleich zu den anderen L-Aminosäure-Pro-Keimungsmitteln spiegelt sich auch in der alternativen Visualisierung in Abb. 2b wider, die die Keimungsreaktion als Steigung statt als Heatmap zeigt. Die Dominanz von L-Cystein stimmt damit überein, dass es die einzige Aminosäure ist, die sowohl im PB-Screening als auch im Einzelfaktor-Screening identifiziert wurde. Dies spiegelt möglicherweise wider, dass L-Cystein eine starke primäre keimfördernde Wirkung hat, die durch die anderen L-Aminosäuren nicht leicht antagonisiert werden kann. L-Valin und L-Alanin lagen dagegen schwächer auf dem zweiten Platz (Abb. 2a, b). Wir gingen tiefer und fragten, ob es signifikante Wechselwirkungen zwischen den 5 L-Aminosäuren gibt, die die Keimung fördern. Die Ergebnisse dieser Analyse werden als sekundäres Interaktionsdiagramm dargestellt, das die Keimungsreaktion für jedes mögliche Aminosäurepaar zeigt, unabhängig davon, ob es vorhanden ist oder nicht (Abb. 2c). Jedes umrahmte Diagramm befindet sich am Schnittpunkt zweier Aminosäuremarkierungen, eine in derselben Zeile wie die Box (der „Zeilenfaktor“) und die andere in derselben Spalte wie die Box (der „Spaltenfaktor“). In jedem Kastendiagramm stellt die blaue Linie die Basis-Keimungsreaktion für den Spaltenfaktor dar und die rote Linie zeigt die veränderte Keimungsreaktion, wenn der Zeilenfaktor vorhanden ist. Wenn es keine Wechselwirkungen gibt, ist das erwartete Ergebnis, dass die roten und blauen Linien in jedem Boxdiagramm ungefähr parallel sind. Da dies die Beobachtung in Abb. 2c ist, lässt sich daraus schließen, dass es keine starken Wechselwirkungen zwischen den 5 L-Aminosäuren gibt, die die Keimung fördern.

Es wurden vollfaktorielle Experimente mit den Prokeimungsfaktoren (Panels a–c) und Antagonisten der L-Cystein-Keimung (Panels d–f) durchgeführt. Beide Versuchspläne sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt. Die verwendeten Konzentrationen waren die gleichen wie beim Plackett-Burman-Screen. a, d Die Abbildungen zeigen die verschiedenen Kombinationen von Faktoren, sortiert in absteigender Reihenfolge (von oben nach unten) von ΔOD (äußerste rechte Spalte), wie in der Ergänzungstabelle 4 definiert. Die Wirkung (untere Reihe) jeder L-Aminosäure auf ΔOD, Außerdem wird die Reihenfolge in aufsteigender Reihenfolge von links nach rechts angezeigt. b, e Hauptinteraktionsdiagramm der keimungsfördernden L-Aminosäuren (blaue Linien mit Kreisen, Modell ɑ = 0,0001) und der antagonistischen L-Aminosäuren mit L-Cystein (rote Linien mit Kreisen, Modell ɑ = 0,001), das jeweils den Durchschnitt zeigt von ΔOD für jede Aminosäurekonzentration. c, f Sekundäres Interaktionsdiagramm, das die Interaktionen zwischen allen Faktorpaaren zeigt. Blaue Linien mit Kreisen stehen für das Fehlen und rote Linien mit Kreisen für das Vorhandensein der angegebenen L-Aminosäuren. Alle Daten wurden aus zwei unabhängigen Experimenten mit jeweils zwei Wiederholungen gemittelt und stellen mittlere Antwortwerte dar. Positive Steigungen deuten auf positive Auswirkungen auf die Keimung hin, während negative Steigungen auf hemmende Wirkungen hinweisen.

Da das PB-Screening auch Aminosäuren identifiziert hatte, die die Keimung verhinderten, verwendeten wir denselben Satz vollfaktorieller Analysen, um die Wirkung dieser vier negativen Faktoren (Glycin, L-Arginin, L-Lysin und L-Tryptophan) auf L. zu untersuchen -Cystein-induzierte Keimung. In der vollfaktoriellen Heatmap ist ersichtlich, dass L-Cystein für eine starke Keimungsreaktion notwendig, aber nicht ausreichend ist (Abb. 2d). L-Cystein ist in den oberen 4 Reihen vorhanden, wo die einzige signifikante Keimung stattfindet. Die keimfördernde Wirkung von L-Cystein sinkt auf Null, wenn entweder L-Arginin oder L-Glycin vorhanden sind. Die alternative Visualisierung in Abb. 2e bestätigt diese Beobachtung und zeigt eine schwächere Wechselwirkung mit L-Lysin. Diese Intuition wird durch das sekundäre Interaktionsdiagramm (Abb. 2f) noch verstärkt, das nicht parallele blaue und rote Linien für mehrere Boxdiagramme zeigt. Wie erwartet ist eine Abweichung von der Parallelität bei den 4 Kastendiagrammen im Zusammenhang mit L-Cystein + L-Glycin und L-Cystein + L-Arginin zu beobachten. Darüber hinaus gibt es auch Abweichungen von der Parallelität bei den beiden Kastendiagrammen im Zusammenhang mit L-Arginin und L-Glycin. In beiden Diagrammen ist das Fehlen von L-Arginin und L-Glycin mit einer durch L-Cystein ausgelösten hohen Keimung verbunden. Das Vorhandensein von entweder L-Arginin oder L-Glycin oder beiden führt jedoch zu keiner Keimung. Die obigen vollständigen Faktoranalysen deuten darauf hin, dass inhibitorische Aminosäuren in der natürlichen Umgebung als antagonistische Modifikatoren für die starke keimfördernde Wirkung von L-Cystein wirken können. Interessanterweise zeigte L-Tryptophan, das im PB-Screen eine hemmende Wirkung hatte, einen sehr leicht positiven Effekt auf die Keimung. Die Wirkung bestimmter Aminosäuren auf die Keimung kann daher stark kontextabhängig sein, was die Notwendigkeit unterstreicht, den kombinatorischen Raum der in Frage kommenden Keimarten zu untersuchen.

Als nächstes testeten wir Purinderivate, die nach L-Aminosäuren die zweithäufigste Keimungsklasse für Bakteriensporen sind. Purinkandidaten wurden parallel unter Verwendung der Vollfaktor- und Einzelfaktor-Screens getestet, es wurde jedoch festgestellt, dass keiner in beiden Screens eine Keimung auslöste (Ergänzende Abbildungen S2a – S2c). Da Purine bekanntermaßen als Co-Keimungsmittel wirken29 und die Anzahl der getesteten Purine gering war, haben wir ein vollständiges faktorielles Screening mit allen möglichen Kombinationen von 5 Purinen entworfen. Als Ausgangsbedingung wurde eine suboptimale L-Cystein-Konzentration verwendet, die nicht ausreichte, um eine vollständige Keimung auszulösen. Jegliche kokeimende Aktivität gegenüber L-Cystein würde sich daher durch einen erhöhten Abfall der OD600 bemerkbar machen. Die Ergebnisse zeigen eindeutig, dass sowohl Hypoxanthin als auch Inosin wirksame Co-Keimungsmittel für die L-Cystein-vermittelte Keimung sind, während Adenosin, Xanthin und Xanthosin die Keimung hemmen (Abb. 3a, b). Das Diagramm der sekundären Wechselwirkung (Abb. 3c) zeigt außerdem nicht parallele Linien für die Diagramme zwischen Hypoxanthin und Inosin. Hier reichen entweder Hypoxanthin oder Inosin allein als Co-Keimungsmittel aus, um eine starke Keimung auszulösen, und das Ausmaß der Keimung wird durch die Anwesenheit beider nicht verbessert. Bemerkenswert sind auch die weniger dramatischen nichtparallelen Diagramme für Hypoxanthin vs. Adenosin und Hypoxanthin vs. Xanthosin. Diese zeigen, dass die keimfördernde Wirkung von Hypoxanthin durch Adenosin und Xanthosin leicht antagonisiert wird.

Die Keimungsreaktion wurde in Gegenwart von L-Cystein (10 mM) für alle Purinkombinationen (0,1 mM) gemäß dem in der Ergänzungstabelle 2 (Tafeln a–c) beschriebenen faktoriellen Design gemessen. a Die Abbildung zeigt die verschiedenen Kombinationen von Purinen in Gegenwart des Hauptkeimmittels L-Cystein, sortiert in absteigender Reihenfolge (von oben nach unten) von ΔOD (äußerste rechte Spalte), wie in der Ergänzungstabelle 4 definiert. Die Abbildung zeigt auch den Effekt (untere Reihe). ) jedes Purins auf ΔOD, in aufsteigender Reihenfolge von links nach rechts angeordnet. b Diagramm der Hauptinteraktionen für die fünf Purinanaloga (blaue Linien mit Kreisen, Modell ɑ = 0,0005). c Sekundäres Interaktionsdiagramm, das die Interaktionen zwischen allen Faktorenpaaren zeigt. Blaue Linien mit Kreisen stehen für das Fehlen und rote Linien mit Kreisen für das Vorhandensein der angegebenen Purine. d Strukturen der fünf Purin-Analoga. Ein reduzierter Purinring mit einer C2-N3-Doppelbindung (grüner Pfeil) ist mit der Keimung verbunden. Alle Daten wurden aus zwei unabhängigen Experimenten mit jeweils zwei Wiederholungen gemittelt und stellen mittlere Antwortwerte dar.

Um zu verstehen, ob diese co-keimenden Effekte kontextabhängig waren, haben wir dieselben 5 Purine einzeln getestet, also nicht in Kombinationen (ergänzende Abbildung S2c). Hier stellten wir fest, dass Hypoxanthin und Inosin immer noch starke Kokeimungseffekte zeigten, was das frühere vollfaktorielle Experiment bestätigte. Darüber hinaus zeigte Adenosin jedoch auch eine signifikante kokeimende Wirkung, im direkten Gegensatz zu seiner hemmenden Wirkung im vollfaktoriellen Experiment. Solche kontextuellen Auswirkungen für Adenosin sind nicht beispiellos. Adenosin hemmt beispielsweise die durch Inosin ausgelöste Keimung von Bacillus cereus-Sporen und fungiert gleichzeitig als Co-Keimungsmittel mit L-Alanin30. Im Fall von C. novyi-NT scheint es, dass Adenosin in Abwesenheit anderer Purine als starkes Mitkeimungsmittel wirken kann, ansonsten aber möglicherweise nicht.

Durch den Vergleich der Strukturen der getesteten Purine mit der Keimungsaktivität stellen wir fest, dass Hypoxanthin, Inosin und Adenosin die reduzierte Form des Purinrings gemeinsam haben, der eine Doppelbindung zwischen N3 und C2 aufweist, die für die gemeinsame Keimungsaktivität wichtig sein könnte ( Abb. 3d). Xanthosin und Xanthin hingegen haben die oxidierte Purinform gemeinsam und weisen ein Carbonyl an C2 auf, das für ihre Hemmwirkung verantwortlich sein könnte. Diese Beobachtungen sind korrelativ und erfordern weitere Struktur-Aktivitäts-Studien, um die Kausalität festzustellen.

Keimungsrezeptoren sind bei der Erkennung von L-Aminosäure-Keimlingen oft stereospezifisch, wobei ein Stereoisomer die Keimung auslöst und das andere sie hemmt. Bacillus subtilis ist ein klassisches Beispiel, bei dem die durch L-Alanin induzierte Keimung durch D-Alanin gehemmt wird31. Wir fragten uns, ob die Keimung durch L-Cystein, L-Alanin und L-Valin durch ihre stereoisomeren Partner antagonisiert werden könnte, was möglicherweise Hinweise auf die Hierarchie der Keimungssignale geben könnte.

Um diese Frage zu beantworten, wurden die Keimungsreaktionen auf diese drei Faktoren in Gegenwart oder Abwesenheit von D-Cystein, D-Alanin und D-Valin gemessen. Alle Keime wurden durch D-Alanin stark gehemmt, was zeigt, dass diese Keime über Signalwege und nicht über physikalisch-chemische Reize wirkten (Abb. 4a, b). D-Cystein zeigte ebenfalls eine hemmende Wirkung, jedoch für eine Untergruppe von Keimstoffen (L-Cystein und L-Valin). Die hemmende Wirkung von D-Alanin war selbst in komplexen Medien wirksam und demonstrierte seine potenzielle Rolle als Haupthemmschalter. (Abb. 4c). Im Vergleich dazu ermöglichte D-Cystein die Keimung in komplexen Medien. In Fällen, in denen D-Alanin die Sporenkeimung bei anderen Bakterien hemmt, ist es häufig im Sporenpeptidoglycan vorhanden oder wird während der Keimung freigesetzt, um eine vorzeitige Keimung zu minimieren, ein Phänomen, das als Autoinhibition bezeichnet wird32,33. Die LC-MS-Analyse zeigte, dass dies bei C. novyi-NT der Fall ist, wobei D-Alanin im Peptidoglycan ruhender und gekeimter Sporen sowie vegetativer Bakterien vorhanden war, obwohl es während der Keimung nicht aktiv in das Medium freigesetzt wurde. (Abb. 4d). Bilder von Sporen, die in der LC-MS-Analyse verwendet wurden, sind in der ergänzenden Abbildung S3 dargestellt.

a Streupunktdiagramm der prozentualen Keimung (wie in der Ergänzungstabelle 4 definiert) durch L-Aminosäure-Keimstoffe (91,5 mM) in Gegenwart von möglichen D-Aminosäure-Inhibitoren (91,5 mM). Grüne, rote und blaue Kreise beziehen sich jeweils auf L-Cystein, L-Alanin und L-Valin. Alle Daten zeigen den Mittelwert ± SD, n = 4 biologisch unabhängige Proben. Signifikanz bei ****p ≤ 0,0001 (ungepaarter t-Test). b Zusammenfassende Tabelle der Ergebnisse aus (a). c Phasenkontrastbilder von Sporen, die über Nacht in RCM-FBS-Oxyrase-Medien mit D-Alanin (93,5 mM), D-Cystein (93,5 mM) und Wasser inokuliert wurden. Die Bilder sind am besten repräsentativ für zwei unabhängige Experimente. Vergrößerung 1600×, Maßstabsleiste 2 µm. d LC-MS EIC-Spektren von derivatisierten Alaninionen (351 m/z) für Standards von L-Alanin, D-Alanin und Proben von Peptidoglycanextrakten aus ruhenden Sporen, gekeimten Sporen, vegetativen Bakterien und Überständen von in L-Cystein gekeimten Sporen , L-Alanin, L-Valin oder D-Valin. Die gepunkteten Linien stellen Standardpeaks für L-Alanin und D-Alanin bei Retentionszeiten von 13,4 bzw. 14,05 Minuten dar. Die gezeigten Daten sind der beste Vertreter der vom Wasserleerwert subtrahierten Spektren aus zwei unabhängigen Experimenten.

Der letzte Inhibitorkandidat, D-Valin, hemmte keinen der Keimlinge, ganz im Gegenteil, er schien sogar zur durch L-Valin induzierten Grundkeimung beizutragen (Abb. 4a).

Fasziniert von den D-Valin-Ergebnissen führten wir ein Einzelfaktor-Keimungsscreening mit einer Gruppe von 19 D-Aminosäuren durch. Zu unserer Überraschung konnte D-Valin tatsächlich die Sporenkeimung von C. novyi-NT auslösen und war die einzige D-Aminosäure, die dazu in der Lage war (Abb. 5a). Mit D-Valin gekeimte Sporen erschienen unter dem Phasenkontrastmikroskop phasendunkel, was dieses erste Ergebnis bestätigte (Abb. 5b).

ein Einzelfaktor-Screening für 19 D-Aminosäuren, bei dem jede D-Aminosäure einzeln auf Keimung bei den in der Ergänzungstabelle 3 angegebenen Konzentrationen getestet wurde. Die gestrichelte Linie stellt eine Keimungsschwelle von 10 % dar. D-Aminosäuren werden in absteigender Reihenfolge des Keimungsprozentsatzes von links nach rechts sortiert. Signifikant bei ****p ≤ 0,0001 (ungepaarter t-Test) im Vergleich zu D-Threonin. b Phasenkontrastbild von C. novyi-NT-Sporen, die mit D-Valin (45,7 mM) gekeimt wurden, bei 1000-facher Vergrößerung. Maßstabsbalken 5 µm. c Dosis-Wirkungs-Kurve für die Keimungsreaktion bei verschiedenen Konzentrationen von D-Valin (schwarz), L-Cystein (grün), L-Alanin (rot) und L-Valin (blau), normalisiert auf die Keimung mit D-Valin in der höchsten Konzentration 91,5 mM. Kreise stellen einzelne Werte dar. Durchgezogene Linien stellen die Regressionskurve der kleinsten Quadrate dar. Der schattierte Bereich zeigt die 95 %-Konfidenzfehlerbänder für jede L-Aminosäure-Anpassung. EC50-Werte werden in der Legende angezeigt und sind im Vergleich zu D-Valin bei ****p ≤ 0,0001,***p ≤ 0,001,**p ≤ 0,01 (ungepaarter t-Test) signifikant. d Keimung durch D-Valin (91,5 mM) in Gegenwart anderer D- und L-Aminosäuren (91,5 mM). Signifikant bei ****p ≤ 0,0001 (ungepaarter t-Test) im Vergleich zur DIW-Kontrolle. e LC-MS EIC-Spektren von derivatisierten Valin-Ionen (379 m/z) für Standards von L-Valin, D-Valin und Proben von Peptidoglycan-Extrakten ruhender Sporen, gekeimter Sporen, vegetativer Bakterien und Überstände von in L-Cystein gekeimten Sporen , L-Alanin, L-Valin oder D-Valin. Die gezeigten Daten sind der beste Vertreter der vom Wasserleerwert subtrahierten Spektren aus zwei unabhängigen Experimenten. Gepunktete Linien stellen die Standardpeaks für L-Valin (20,34 Min.) bzw. D-Valin (20,73 Min.) dar. Alle Keimungsdaten zeigen den Mittelwert ± SD, n = 4 biologisch unabhängige Proben. Der Keimungsgrad für alle Diagramme ist in der Ergänzungstabelle 4 definiert.

Die Kinetik der D-Valin-Keimung, gemessen anhand der OD- und Dipicolinsäure (DPA)-Freisetzung, war ähnlich wie bei L-Cystein und L-Alanin (ergänzende Abbildung S4). Es stellte sich auch heraus, dass im Vergleich zu L-Cystein oder L-Alanin deutlich geringere Konzentrationen von D-Valin erforderlich waren, um die Keimung auszulösen, was zeigt, dass D-Valin als Keimmittel wirksamer war (Abb. 5c). Genau wie L-Cystein und L-Valin könnte die Keimung von D-Valin sowohl durch D-Cystein als auch durch D-Alanin gehemmt werden, was einen weiteren Beweis dafür liefert, dass D-Valin ein echtes Keimmittel ist (Abb. 5d).

Die Beobachtung, dass D-Valin unabhängig die Keimung von C. novyi-NT auslösen kann, widerspricht der allgemeinen Annahme, dass L-Aminosäuren die Keimung fördern, während D-Aminosäuren sie hemmen. Es wurde bisher nicht nachgewiesen, dass speziell D-Valin eine aktive Rolle bei der Keimung von Bakteriensporen spielt. Könnte D-Valin eine Rolle als Signalmolekül spielen und wenn ja, woher stammt dieses D-Valin? Da die meisten Bakterien während der stationären Phase D-Aminosäuren (hauptsächlich D-Alanin, D-Glutamin und manchmal D-Valin) in ihr Peptidoglycan einbauen34, fragten wir uns, ob D-Valin ein Bestandteil der Peptidoglycanschicht der Sporenrinde sein könnte34,35 ,36,37. Um diese Frage zu beantworten, wurde die Peptidoglycanschicht aus ruhenden Sporen, gekeimten Sporen und vegetativen Bakterien extrahiert, hydrolysiert und mittels Derivatisierungs-LC-MS analysiert (Abb. 5e und ergänzende Abb. S3). Diese Analyse ergab, dass D-Valin im Peptidoglycan der Sporen- oder vegetativen Formen nicht vorhanden war, obwohl L-Valin in beiden vorhanden war (Abb. 5e). Darüber hinaus fehlte D-Valin im Überstand der mit L-Cystein, L-Alanin oder L-Valin gekeimten Sporenproben (Abb. 5e und ergänzende Abb. S3), was zeigt, dass D-Valin weder ein Bestandteil des Sporenpeptidoglycans war noch noch während der Keimung freigesetzt. Es ist denkbar, dass es in den Sporen von C. novyi-NT eine D-Valin-spezifische Racemase gibt, die L-Valin erzeugt. Allerdings wurde L-Valin in mit D-Valin gekeimten Sporen nicht nachgewiesen, was dies unwahrscheinlich macht (Abb. 5e).

Da gezeigt wurde, dass die Spore keine Quelle für D-Valin ist und angesichts der vermuteten Knappheit von D-Valin in von C. novyi-NT besiedelten Säugetiergeweben, fragten wir, ob ein Analogon von D-Valin das tatsächlich relevante Keimmittel sein könnte . Wir haben eine Sammlung von D-Valin-Analoga gescreent (ergänzende Abbildung S5) und 5 Analoga entdeckt, die Keimungsaktivität zeigten (Abb. 6a). Interessanterweise umfassten vier dieser Analoga zwei Paare von Stereoisomeren; L-Norvalin und D-Norvalin sowie L-2-Aminobuttersäure (L-AABA) und D-2-Aminobuttersäure (D-AABA). Diese beiden Paare spiegeln unsere Beobachtung mit Valin wider, wobei sowohl L- als auch D-Enantiomere Keimungsaktivität zeigen. Da zuvor gezeigt wurde, dass D-Alanin und D-Cystein die Keimung durch L- und D-Valin hemmen, führten wir das gleiche Experiment durch und beobachteten, dass D-Alanin und D-Cystein auch in der Lage waren, die durch die Valin-Analoga induzierte Keimung zu hemmen ( Abb. 6b). Dies legt nahe, dass diese Analoga über denselben Signalweg wie L- und D-Valin wirken und möglicherweise über denselben Keimrezeptor. L-AABA und D-Norvalin, die stärksten Keimstoffe unter den Analoga, haben eine ähnliche Wirksamkeit wie L-Cystein (Abb. 6c).

ein Einzelfaktor-Screening stereoisomerer Strukturanaloga von D-Valin. Alle Analoga hatten eine Konzentration von 91,5 mM. Als Referenz-Positivkontrollen (grau) wurden D-Valin und L-Valin verwendet. Alle Valinanaloga mit einer Keimfähigkeit >10 % (grün) wurden als Keimstoffe identifiziert. Signifikant bei ****p ≤ 0,0001,***p ≤ 0,001,**p ≤ 0,01,*p ≤ 0,05, ns p > 0,05 (ungepaarter t-Test) im Vergleich zu 4-Aminobuttersäure. b Keimungsreaktion von Valinanaloga (91,5 mM) L-2-Aminobuttersäure (orangefarbene Kreise), D-2-Aminobuttersäure (rosa Kreise), L-Norvalin (dunkelgrüne Kreise), D-Norvalin (violette Kreise), S -(3)-Aminobuttersäure (graue Kreise) in Gegenwart der Inhibitoren D-Cystein und D-Alanin (91,5 mM Konzentration). Signifikant bei ****p ≤ 0,0001,***p ≤ 0,001,**p ≤ 0,01,*p ≤ 0,05, ns p > 0,05 (ungepaarter t-Test) im Vergleich zu entsprechenden Wasserkontrollen. c Dosis-Wirkungs-Kurve für die Keimungsreaktion bei verschiedenen Konzentrationen von L-2-Aminobuttersäure (orange), D-Norvalin (lila) und L-Cystein (grün) (normalisiert auf Keimung mit D-Valin bei der höchsten Konzentration von 91,5 mM). Wirksamkeit von Valin-Analoga ähnlich wie L-Cystein. Kreise stellen einzelne Werte dar. Durchgezogene Linien stellen die Regressionskurve der kleinsten Quadrate dar. Der schattierte Bereich zeigt die 95 %-Konfidenzfehlerbänder für jede Aminosäureanpassung. EC50-Werte werden in der Legende angezeigt. d Vorgeschlagenes Zweikomponenten-Signalisierungsgerüst für die Keimung von C. novyi-NT. Alle Keimungsdaten zeigen den Mittelwert ± SD, n = 4 biologisch unabhängige Proben. Der Keimungsgrad für alle Diagramme ist in der Ergänzungstabelle 4 definiert.

Wir haben uns gefragt, ob Valin, AABA und Norvalin möglicherweise Metaboliten im vegetativen C. novyi-NT sind. Metaboliten aus gekeimten Stäbchenformen könnten theoretisch als Keimstoffe dienen, um die Keimung von Sporen weiter voranzutreiben. LC-MS-Analysen für Valin und Norvalin wurden an Stäben durchgeführt, die in flüssigem Medium gezüchtet wurden, und zeigten, dass beide in pelletiertem vegetativem C. novyi-NT und in durch sein Wachstum konditionierten Medien nicht vorhanden waren (ergänzende Abbildung S6a). Aus technischen Gründen wurde die gleiche LC-MS-Analyse für AABA an auf Agarmedium gewachsenen Kolonien durchgeführt. Hier wurde beobachtet, dass L-AABA in C. novyi-NT-Stäbchen vorhanden war, D-AABA jedoch fehlte (ergänzende Abbildung S6b). L-AABA ist nicht nur ein mutmaßlicher Metabolit von C. novyi-NT, sondern auch ein unspezifischer Marker für Sepsis38 sowie ein Metabolit, der von anderen ähnlichen nekrotisierenden Clostridien wie C. botulinum und C. sordelli39,40 produziert wird Dies deutet darauf hin, dass die Umwelt eine potenzielle Quelle für L-AABA ist. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass D-Aminosäuren und ihre Analoga möglicherweise eine noch unentdeckte Rolle bei der Keimung von Bakteriensporen spielen.

DOE hat in dieser Studie eine wichtige Rolle gespielt. In einem Einzelfaktor-Screening wären nur L-Cystein und L-Alanin als Keimstoffe identifiziert worden. Die Kombination von DOE mit Einzelfaktor-Screenings führte zur weiteren Entdeckung von Keimförderern und Inhibitoren, die nur in Kombination wirken, und trieb die Reihe von Untersuchungen voran, die D-Valin und seine Analoga als echte Keimförderer identifizierten. Die Auswirkungen einzelner Faktoren, die unabhängig voneinander wirken, können von den Auswirkungen kombinierter Faktoren abweichen. Daher hoffen wir, dass dieses Tool in Studien zur Keimung von Bakteriensporen häufiger eingesetzt wird. Solche Wechselwirkungen zwischen Faktoren würden insbesondere in der realen Welt, in der die Spore lebt, existieren, und DOE stellt eine effiziente Möglichkeit dar, den kombinatorischen Raum effizienter zu untersuchen und zu verstehen.

Bei dieser ersten Verwendung von DOE in einem Screening auf keimende Bakteriensporen haben wir die wichtigsten keimenden Wirkungen für C. novyi-NT identifiziert. Obwohl ein vollständiger Signalweg noch nicht vollständig beschrieben werden kann, liegen genügend Informationen vor, um einen rudimentären Rahmen für die Abfolge der Keimungssignalereignisse abzuleiten (Abb. 6d). Dieser rein hypothetische Rahmen basiert auf der zusammenfassenden Tabelle der Faktoren in Abb. 6d und muss überarbeitet werden, sobald weitere experimentelle Daten verfügbar sind. In diesem Rahmen gibt es zwei Platzhalterelemente A und B, die Signale von Keimmitteln und Inhibitoren zusammenfassen. Hier liegt B stromabwärts von A, und die Keimung erfolgt stromabwärts von B. Da D-Alanin alle Keimlinge hemmt, ist es wahrscheinlicher, dass es auf B einwirkt, das das am weitesten stromabwärts gelegene Element ist. Im Gegensatz dazu ist die Hemmung von D-Cystein nicht absolut, und daher schlagen wir vor, dass es stromaufwärts auf Element A wirken könnte. Unter Verwendung ähnlicher Überlegungen sind die durch D-Cystein gehemmten Keimlinge (L-Cystein; L/D-Valin und ihre Analoga) würde auch auf dasselbe Element A einwirken. Da L-Alanin der Hemmung durch D-Cystein, nicht aber durch D-Alanin entgeht, kann es schließlich auf das stromabwärts gelegene Element B einwirken.

A und B sind Platzhalter für Teilnehmer an der Keimsignalübertragung, die noch nicht identifiziert wurden. Beide könnten entweder einzelne oder mehrere Signalteilnehmer darstellen, und diese Teilnehmer könnten möglicherweise von zwei Sätzen von Keimungsoperons (NT01CX_0189-0191 und NT01CX_0562-564) innerhalb des C. novyi-NT-Genoms abstammen41. Insbesondere NT01CX_0191, NT01CX_0562 und NT01CX_0564 weisen hohe Sequenzähnlichkeiten zu Genen der Keimrezeptorfamilie in B. cereus und C. botulinum auf (Ergänzungstabelle 6) und sind daher interessante Kandidaten für zukünftige Untersuchungen.

Von allen Keimungsklassen kommen in allen bekannten Bakteriensporen nur die L-Aminosäuren allgemein als keimungsfördernde Faktoren vor. Die Erkennung von Aminosäurekeimstoffen wird durch Ger-Typ-Rezeptoren erleichtert, die in fast allen sporulierenden Clostridien und Bacillusen vorhanden sind42. Eine seltene Ausnahme von dieser Regel ist C. difficile, das den Csp-Typ-Rezeptor (CspA)43,44 verwendet. Es überrascht nicht, dass in allen Keimungsstudien mit Clostridium mindestens eine Aminosäure als Keimungsförderer (d. h. entweder als Keimungsförderer oder als Mitkeimungsförderer) identifiziert wurde45. Wie schneiden die keimungsfördernden Aminosäurefaktoren von C. novyi-NT im Vergleich zu anderen Clostridien ab? In einer Untersuchung von 14 Clostridien (einschließlich C. novyi-NT aus dieser Studie) war L-Alanin (10/14) das häufigste keimfördernde Mittel, gefolgt von L-Cystein (7/14) (Ergänzungstabelle 7). C. novyi-NT folgt diesem beliebten Trend, indem es diese beiden L-Aminosäuren als Prokeimungsmittel verwendet. Zusätzlich zu diesen beiden L-Aminosäuren weisen Clostridien in geringerer Häufigkeit auch andere L-Aminosäuren als keimfördernde Faktoren auf. C. novyi-NT ist nicht anders und zeigt eine Keimreaktion auf L-Valin. C. novyi-NT keimt auch als Reaktion auf nichtkanonische Keimstoffe, die keine klassischen L-Aminosäuren sind, wie z. B. L-Norvalin und L-2-Aminobuttersäure. In diesem Sinne ähneln sie C. frigidicarnis, das auf L-Norvalin reagiert46, und C. difficile, das sowohl auf L-Norvalin als auch auf L-2-Aminobuttersäure reagiert47. L-2-Aminobuttersäure kann als Nährkeimstoff metabolische Bedeutung haben, da sie als intrazellulärer Metabolit im vegetativen C. novyi-NT produziert wird. Eine Möglichkeit besteht darin, dass die Keimung von L-2-Aminobuttersäure als positives Feedback von früh keimenden Sporen wirkt und die weitere Keimung fördert. Darüber hinaus bedeutet die strukturelle Ähnlichkeit von L-2-Aminobuttersäure mit L-Norvalin und L-Valin, dass alle drei möglicherweise an denselben Keimungsrezeptor binden (ergänzende Abbildung S5). Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um diese Hypothesen zu klären.

Bisher handelt es sich bei praktisch allen für Clostridien gemeldeten keimfördernden Aminosäuren um L-Aminosäuren. Die einzigen Clostridien, die von diesem Trend abweichen, sind C. bifermentans (das D-Alanin, D-Arginin und D-Serin als Co-Keimungsmittel verwendet)48,49, C. difficile (das D-Alanin oder D-Serin als Co-Keimungsmittel verwendet). ein Co-Keimungsmittel)50 und in dieser Studie C. novyi-NT (das als Reaktion auf D-Valin und seine Analoga keimt). Da C. bifermentans, C. difficile und C. novyi-NT unseres Wissens die einzigen Clostridien sind, bei denen die D-Aminosäuren-Panels auf keimfördernde Aktivität untersucht wurden, ist das tatsächliche Vorkommen von D-Aminosäure-Keimstoffen unter den Clostridien wird sehr wahrscheinlich unterschätzt.

Es kommt häufig vor, dass D-Aminosäuren als Keiminhibitoren wirken können, da einzelne L-Aminosäure-Keimlinge normalerweise durch ihre D-Aminosäure-Spiegelbilder antagonisiert werden. Wir waren daher überrascht, dass D-Valin nicht nur die L-Valin-Keimung nicht antagonisierte, sondern dass sich D-Valin als sogar wirksameres Keimmittel als L-Valin erwies. Eine weitere unerwartete Beobachtung war, dass D-Alanin die Keimung von Sporen in verstärktem Clostridienmedium, einem komplexreichen Kulturmedium, verhinderte. Empirisch gesehen können D-Aminosäuren ein breiteres Spektrum von Keimen hemmen als nur ihre L-Aminosäure-Gegenstücke. Am Beispiel von C. sporogenes hat sich gezeigt, dass D-Serin die Keimung zu L-Serin und zusätzlich zu L-Cystein, L-Methionin und L-Phenylalanin hemmt51. D-Alanin, von dem gezeigt wurde, dass es die Keimung von Bacillus thiaminolyticus in ähnlicher Weise wie L-Glutamin, L-Norvalin, L-Serin, L-Methionin und L-Threonin hemmt, ist nicht anders52. Trotz dieser Beispiele hat keine frühere Studie die scheinbar absolute Keimhemmung gezeigt, wie sie bei D-Alanin in dieser Studie beobachtet wurde. Eine Möglichkeit könnte der Mangel an Studien sein, in denen die D-Alanin-Hemmung in reichhaltigen komplexen Medien getestet wird. Eine andere Erklärung ist, dass die Keimsignalisierung bei C. novyi-NT möglicherweise auf einen einzigen Gatekeeper konvergiert, während die Art der Keimsignalisierung bei anderen Clostridien möglicherweise paralleler ist und mehrere redundante Wege zur Auslösung der Keimung aufweisen.

Während die Besonderheiten der Keimung von C. novyi-NT noch geklärt werden müssen, werden in dieser Arbeit zwei große Themen hervorgehoben. Erstens können Keimungsfaktoren entweder mit einem hohen Maß an Unabhängigkeit (wie L-Cystein und D-Alanin) oder voneinander abhängig (wie L-Alanin oder L-Threonin) wirken. Während wir uns daran gewöhnt haben, die Keimung von Sporen als Einzelakteure zu betrachten, zeigen unsere Daten, dass die keimenden Eigenschaften bestimmter Aminosäuren abhängig von der Anwesenheit anderer Aminosäuren entstehen oder verschwinden können. Der PB-Bildschirm in unserer Studie kann das Vorhandensein von Wechselwirkungen anzeigen, ist jedoch nicht darauf ausgelegt, diese Wechselwirkungen im Detail zu untersuchen. Daher muss mehr Arbeit geleistet werden, um die Natur dieser Wechselwirkungen aufzuklären.

Stereoflexibilität ist das zweite Thema. Die Natur ist wählerisch in Bezug auf Chiralität, und daher erkennen Sporenkeimungsrezeptoren normalerweise bestimmte L-Aminosäuren als ihre zugehörigen Keimungsmoleküle. Die D-Aminosäure-Enantiomere dieser Keimstoffe können andererseits diese Wechselwirkungen unterbrechen und somit die Keimung hemmen51. Dieses einfache und elegante homochirale Modell muss möglicherweise angesichts neuer Forschungsergebnisse, die zeigen, dass D-Serin und D-Alanin als Co-Keimungsmittel für C. difficile fungieren könnten, überarbeitet werden50,53. In dieser Forschung wurde durch die genetische Inaktivierung von alr2, einer Alaninracemase, die gemeinsame Keimungsaktivität dieser D-Aminosäuren außer Kraft gesetzt, was zeigt, dass die Umwandlung in die L-Form für die Keimungsaktivität wesentlich war. Obwohl eine Racemase-Aktivität, die die Umwandlung von D-Valin in L-Valin-Racemase-Aktivität beinhaltet, theoretisch die Stereoflexibilität von C. novyi-NT erklären könnte, wurde eine solche Racemase-Aktivität in dieser Studie nicht nachgewiesen. Alternativ ist es auch möglich, dass es in C. novyi-NT einen Keimungsrezeptor gibt, der stereoflexibel an Aminosäuren bindet. Es besteht sicherlich Bedarf an weiteren Untersuchungen, um diese möglichen Erklärungen eindeutig zu klären. Im Gegensatz zu C. difficile fungieren D-Valin und seine Analoga in C. novyi-NT nicht als Co-Keimungsmittel, sondern als primäre Keimungsmittel, wobei die Keimwirkung mit L-Cystein, dem wichtigsten L-Aminosäure-Keimungsmittel, konkurriert. Diese Daten sind ein noch stärkerer Beweis dafür, dass das homochirale Modell unvollständig ist.

Nach ersten Prinzipien bestimmt das Keimvokabular eines sporenbildenden Bakteriums die Nische, die es bewohnt. Daher ist davon auszugehen, dass die Keimerkennung nicht auf einigen wenigen Schlüsselnährstoffen basiert, sondern auf einer gebündelten Erfassung der Umwelt. Komplexe Interaktionen und stereoflexible Wahrnehmung könnten der Schlüssel sein, der die Tür zum wahren Keimvokabular bakterieller Sporen öffnet. Sie könnten auch den ersten Grundstein für das Verständnis und die Verbesserung der Fähigkeit von C. novyi-NT zur Tumorbesiedelung legen.

Solide Tumoren sind schlecht vaskularisiert und enthalten Bereiche mit Hypoxie und Nekrose54. Diese Eigenschaft korreliert mit schlechteren Ergebnissen bei Strahlen- und Chemotherapie, bietet aber auch eine therapeutische Möglichkeit für Sporen streng anaerober Clostridien, Krebszellen zu besiedeln und abzutöten55. Allerdings sind nicht alle Clostridien für diesen Zweck gleich geschaffen. Obwohl es sich bei allen um obligate Anaerobier handelt, wurde in einer Studie festgestellt, dass nur zwei der acht getesteten Stämme (C. novyi-NT und C. sordelli) die hypoxischen Regionen von experimentellen Tumoren effektiv besiedeln4.

Ein Faktor, der die Kolonisierungseffizienz beeinflussen könnte, ist das Ausmaß, in dem wichtige Keimstoffe in der Mikroumgebung des Tumors vorhanden sind. Mehrere Prokeimungsfaktoren von C. novyi-NT sind in dieser Hinsicht in soliden Tumoren gut angereichert. Es wurde beispielsweise gezeigt, dass intratumorales L-Cystein in bestimmten Tumoren bis zu 1,40 mM erreicht56 und damit den durchschnittlichen Ausgangswert von ~0,2 mM im Plasma überschreitet57. Es wird angenommen, dass erhöhte intratumorale Cysteinspiegel Krebszellen vor den Auswirkungen von Strahlentherapie58 und Chemotherapie59 schützen, möglicherweise aber auch die Keimung von C. novyi-NT in diesen behandlungsresistenten Nischen fördern. Tatsächlich benötigt C. novyi-NT nur 1 mM L-Cystein in Kombination mit einem der Co-Keimungsmittel (Hypoxanthin oder Inosin), um eine schwache Keimung zu erreichen (ergänzende Abbildung S2d).

Neben L-Cystein sind die Co-Keimstoffe Hypoxanthin und Inosin in Tumoren ebenfalls angereichert60,61. Beide sind Substrate in den Purin-Stoffwechselwegen, die die Proliferation von Krebszellen vorantreiben, und werden aus sterbenden Zellen in nekrotischem und faulendem Gewebe freigesetzt. Bisher ist nicht bekannt, dass Hypoxanthin die Keimung von Bakteriensporen fördert. Andererseits ist Inosin mit anderen gewebebesiedelnden Bakterien assoziiert, entweder als Keimmittel (B. cereus29, Bacillus anthracis62) oder als Mitkeimmittel (Clostridium botulinum Typ E63). Zusammengenommen haben die Tumorkonzentrationen von L-Cystein, Hypoxanthin und Inosin wahrscheinlich einen wichtigen Einfluss auf die Kolonisierung und könnten zu den Variationen in der Keimung beitragen, die zwischen verschiedenen Krebspatienten beobachtet werden, die mit C. novyi-NT-Sporen behandelt werden64.

Da wir nun ein umfassenderes Bild davon haben, wie C. novyi-NT-Sporen keimen, können wir möglicherweise die Keimung von Sporen in zuvor nicht reagierenden Tumoren induzieren und so konsistentere Ergebnisse bei verschiedenen soliden Tumoren erzielen. Auch die Entwicklung von Stämmen von C. novyi-NT, die stärker auf einen oder mehrere seiner Keimlinge reagieren, könnte die therapeutische Wirkung dieses vielversprechenden Krebstherapeutikums weiter steigern.

Alle L-Aminosäuren, D-Aminosäuren (außer D-Histidin), Purine, Valinanaloga, Terbiumchlorid (212903), Maltose (M5895), dibasisches Natriumphosphat (S7907), o-Phthaldialdehyd (P0657), N-Acetyl Cystein (A7250), Natriumtetraboratdecahydrat (B3545), Methanol in HPLC-Qualität (34860), 1-Propanol (34871), Trifluoressigsäure (302031) und Mutanolysin-Enzym (M9901) wurden von Sigma bezogen. 2-Propanol (29113-95) wurde von Nacalai Tesque bezogen. D-Histidin (sc-255057) wurde von SantaCruz Biotechnology gekauft. Acetonitril (1,00317) und HCl (1,00029) wurden von Merck bezogen. Percoll (17089109) wurde von GE Healthcare gekauft. Oxyrase für Brühe wurde von Oxyrase Inc und Sigma (SAE0013) gekauft. BBL-Polypepton-Pepton (211910), Medien für dehydriertes gekochtes Fleisch (226730), Gehirn-Herz-Infusionsbrühe (BHI, 237500) und verstärktes Clostridien-Medium (RCM, 218081) wurden von BD bezogen. Fetales Rinderserum (S1810) wurde von iDNA Biotechnology bezogen.

C. novyi-NT war ein Geschenk des Kinzler-Vogelstein-Labors an der John Hopkins University, USA.

Clostridium novyi-NT-Sporen wurden unter Verwendung des Protokolls von Cheong et al.5 hergestellt. Kurz gesagt, 200 µl von 5 × 109 KBE/ml C. novyi-NT-Sporen wurden in 1 l Polypepton und gekochtes, fleischreiches Sporulationsmedium (L-Cystein 0,5 g/l, dibasisches Natriumphosphat oder Na2HPO4 5 g/l, BBL Polypepton (Pepton 30 g/l, dehydriertes gekochtes Fleischmedium 50 g/l, Maltose 10 g/l und FBS 10 % v/v) und die Kultur wurde in einem verschlossenen anaeroben BD GasPakTM-Gefäß sporuliert und drei Jahre lang bei 37 °C inkubiert Wochen. Die Sporen wurden geerntet, indem das Pellet in 1X PBS resuspendiert und die Sporen mit 90 % Percoll-Lösung bei 15.000 rcf 30 Minuten lang in einer Beckman Avanti J-20 XP-Hochleistungszentrifuge von vegetativen Zellen getrennt wurden. Die Qualität der Sporen wurde mittels Phasenkontrastmikroskopie überprüft und es wurde festgestellt, dass sie zu mehr als 99 % phasenhelle Sporen enthielten. Die Sporenkonzentration wurde durch entsprechende Verdünnung in 1x PBS unter Verwendung einer Standardkurve, die die OD600-Absorption mit der Zellzahl korrelierte, auf 5 × 109 KBE/ml eingestellt.

Alle Experimente zur Sporenkeimung wurden anaerob unter Verwendung von Oxyrase als Brühenenzym in einer durchsichtigen Mikrotiterplatte Greiner Bio-One 384 (#781186) durchgeführt. Anaerobe Bedingungen allein lösten keine Keimung aus. Zu 50 µl Keimlösung, die Oxyrase (1:50 v/v) und Keimstoffe in verschiedenen Kombinationen wie unten beschrieben enthielt, wurden 3,5 µl 5 × 109 KBE/ml C. novyi-NT-Sporen in 1 × PBS hinzugefügt. Die Platte wurde mit einer Sealplate-Versiegelungsfolie luftdicht verschlossen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Der OD600-Wert wurde alle 10 Minuten mit einem Tecan Spark® Multimode-Mikroplattenlesegerät über die Spark Control Dashboard V2.2-Software gemessen.

Alle Endpunkt-Keimungsreaktionen wurden ungefähr zum Zeitpunkt t = 7,3 Stunden berechnet. Alle DOE-Screening-Designanalysen wurden mit Minitab 20 durchgeführt. Die Modellanpassungsparameter für alle DOE-Experimente sind in der Ergänzungstabelle 8 aufgeführt. Die Keimungsreaktion für alle DOE-Experimente und Keimungsexperimente auf Einzelfaktorbasis wurde wie in der Ergänzungstabelle angegeben berechnet 4.

Das Plackett-Burman-Design ist ein zweistufiges fraktioniertes faktorielles Screening-Design, das hohe und niedrige Konzentrationen zur Untersuchung von N-1-Variablen unter Verwendung von N-Kombinationen verwendet, wobei N ein Vielfaches von 4 ist. Für die 20 L-Aminosäuren eine 24-Kombination Das Plackett-Burman-Design mit Minitab19 wurde wie in der Ergänzungstabelle 1 gezeigt erstellt und in einer Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen unter Verwendung der automatisierten Arbeitsstation Biomek i5 eingerichtet, wobei jede Vertiefung aus einer bestimmten Kombination aller 20 L-Aminosäuren bestand, aus denen hergestellt wurde ein Mastermix gemäß jeder Zeile in der Ergänzungstabelle 1. Alle 20 L-Aminosäuren wurden mit hohen Stammkonzentrationen hergestellt, die bei Verdünnung um den Faktor 20 und Mischen mit den Sporen die in der Ergänzungstabelle 3 dargestellten Endkonzentrationen (hohe Konzentration) ergaben. Die niedrige Konzentration wurde auf Null gesetzt.

Beim L-Aminosäure-Einzelfaktor-Screen enthielt jede Vertiefung nur eine Aminosäure und die Endkonzentrationen waren doppelt so hoch wie beim PB-Assay (Ergänzungstabelle 3). Das D-Aminosäure-Einzelfaktor-Screening wurde ebenfalls auf ähnliche Weise durchgeführt, jedoch unter Verwendung der Endkonzentrationen beim Mischen mit Sporen, wie in der Ergänzungstabelle 3 gezeigt. Für die D-Valin-Analoga betrug die Endkonzentration beim Mischen mit Sporen 91,5 mM. Die Endkonzentration an Purinen betrug beim Mischen mit Sporen in den kokeimenden Einzelfaktor-Screens 0,1 mM, während der endgültige L-Cystein-Gehalt, der jeder Vertiefung zugesetzt wurde, beim Mischen mit Sporen 10 mM betrug. Für das Keimungsexperiment auf physiologischer Ebene wurden Purine und L-Cystein in Endkonzentrationen von 0,1 bzw. 1 mM verwendet.

Für die Untersuchung der Keimungsreaktion mit Purinen und für die L-Aminosäure-Wechselwirkungsstudie wurde ein vollständig faktorielles Design verwendet, wie in der Ergänzungstabelle 2 dargestellt. Für das kombinatorische Keimungsscreening und das kombinatorische Cokeimungsscreening mit Purinen wurden Stammlösungen von 0,6 mM der jeweiligen Purine in 0,005 N NaOH hergestellt und in Abwesenheit und Gegenwart von L-Cystein (Endkonzentration 10 mM) verdünnt (Endkonzentration 0,1 mM). wobei jede Vertiefung eine Kombination des faktoriellen Designs darstellt. Für die L-Aminosäure-Wechselwirkungsstudien wurden L-Cystein und die positiven Treffer aus dem PB- und Einzelfaktor-Screening bzw. die negativen Treffer aus dem PB-Screening verwendet. Die verwendeten Konzentrationen waren die gleichen wie in der Ergänzungstabelle 3. Alle Tests wurden auf einer Mikrotiterplatte mit 384 Vertiefungen unter Verwendung der automatisierten Workstation Biomek i5 durchgeführt.

Für die Keimhemmungsstudien wurden gleiche Volumina des Keimmittels mit dem Enantiomereninhibitor zugegeben, sodass die Endkonzentrationen beider, wenn sie mit Sporen vermischt wurden, jeweils 91,5 mM betrugen. Für die Dosis-Wirkungs-Experimente wurden Stammlösungen von Keimstoffen mit 100 mM seriell zweifach in entionisiertem Wasser bis zu einer Konzentration von 90 µM verdünnt. Die Endkonzentrationen beim Mischen mit Sporen lagen zwischen 91,5 mM und 89 µM.

Für den Dipicolinat-Freisetzungstest wurden alle Keimstoffe in einer Konzentration von 200 mM hergestellt und in einer Mischung mit 0,1 mM Terbiumchlorid und Oxyrase (1:50 v/v) auf eine Endkonzentration von 100 mM verdünnt. Zu 50 µl dieser Lösung wurden 3,5 µl C. novyi-NT-Sporen in einer Greiner Bio-One 384 UV Star-Mikrotiterplatte gegeben. Die Endkonzentrationen nach der Sporenzugabe betrugen 93,5 mM für Keimlinge und 0,09 mM für Terbium. Der OD600-Wert und die Fluoreszenz bei 545 nm (Verzögerungszeit von 20 µs) wurden alle 10 Minuten mit einem Tecan Spark® Multimode-Mikroplattenlesegerät über die Spark Control Dashboard V2.2-Software gemessen.

Zu RCM-FBS-Medien, die Oxyrase (1:50 v/v) enthielten, wurden die entsprechende D-Aminosäure oder Wasser hinzugefügt, gefolgt von der Zugabe von C. novyi-NT-Sporen in 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen. Die Endkonzentrationen der Komponenten betrugen 93,5 mM D-Aminosäuren, 0,35 × RCM, 9,3 % FBS. Die Kulturröhrchen wurden dann über Nacht bei 37 °C inkubiert und Aliquots der Übernachtkultur wurden dann abgebildet.

Aliquots (10 µl) der Keimungs-/Wachstumsexperimente über Nacht wurden auf einen Superfrost plus-Objektträger gegeben, mit Mikroskopdeckgläsern Nr. 1,5 abgedeckt und dann mit Nagellack versiegelt. Die Objektträger wurden dann auf einem invertierten Axio Observer 7-Mikroskop von Zeiss unter Verwendung eines 100×/1,4 Ph3 Plan APOCHROMAT-Objektivs abgebildet, das auf eine Optovar-Einstellung von 1× oder 1,6× Vergrößerung wie angegeben eingestellt war. Die Bilder wurden mit einer Hamamatsu CMOS-Kamera und Metamorph-Software (Molecular Devices, 7.10.3) mit einer Belichtungszeit von 100 ms im Phasenkontrastmodus aufgenommen. Die Bilder wurden mit ImageJ Version 1.53n zugeschnitten.

Die Protokolle für die Peptidoglycan-Extraktion wurden von Atrih et al. angepasst. (1996, 1998) und Popham et al. (1996) für Sporen und Atrih et al. (1999) für vegetative Bakterien.

Kurz gesagt, 3 ml C. novyi-NT-Sporen (5 × 109 KBE/ml) wurden 30 Minuten lang bei 37 °C in einer Keimlösung gekeimt, die L-Cystein (100 mM), Hypoxanthin (0,1 mM) und Oxyrase (1) enthielt :50 v/v), das bei Verdünnung mit Sporen eine Endkonzentration von L-Cystein (82 mM) und Hypoxanthin (0,08 mM) ergab. Äquivalente Mengen ruhender Sporen in 1X PBS und gekeimter Sporen in entionisiertem Wasser wurden in 1 ml Propan-2-ol bzw. Propan-1-ol resuspendiert und 15 Minuten lang einer Wärmebehandlung bei 85 °C unterzogen. Anschließend erfolgte eine 8-minütige Zentrifugation bei 14000 × g mit einer Beckman Coulter Microfuge 22R-Zentrifuge. Die Pellets wurden in 13 ml und 1 ml 50 mM Tris pH 7,4–4 % SDS–30 mM DTT-2 mM EDTA-Puffer für ruhende bzw. gekeimte Sporenproben resuspendiert. Anschließend wurden die Proben 16 Minuten lang auf 100 °C und anschließend 40 Minuten lang auf 37 °C erhitzt.

Für den Extrakt vegetativer Bakterien wurden 3 Röhrchen einer Nachtkultur von C. novyi-NT (5 ml pro Röhrchen) kombiniert und in 1 ml entionisiertem Wasser resuspendiert. Anschließend wurde die Probe 15 Minuten lang auf 85 °C erhitzt und 8 Minuten lang bei 14.000 × g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 10 ml 5 % SDS resuspendiert und 25 Minuten lang auf 100 °C erhitzt. Die Probe wurde 8 Minuten lang bei 14.000 × g zentrifugiert, in 1 ml 5 % SDS resuspendiert und erneut 15 Minuten lang auf 100 °C erhitzt.

Nach den jeweiligen Wärmebehandlungen wurden die Sporen- und vegetativen Bakterienproben 8 Minuten lang bei 14000 × g zentrifugiert und die Pellets fünfmal mit auf 37 ° C vorgewärmtem entionisiertem Wasser gewaschen. Der Überstand nach dem letzten Zentrifugieren wurde verworfen und die Pellets wurden 16 Stunden lang bei 37 °C mit 250 µl Mutanolysin-Enzym (125 U/ml in 12,5 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,8) behandelt. Anschließend wurden die Proben 8 Minuten lang bei 14.000 × g zentrifugiert und der Überstand über Nacht gefriergetrocknet. Die gefriergetrockneten Pellets wurden dann einer Hydrolyse in 1:1 6 N HCl:Trifluoressigsäure (v/v) in einem Vakuumhydrolyserohr von Thermofisher (Kat.-Nr. 29570) unterzogen und 1 Stunde lang in einem Ölbad auf 160 °C erhitzt. Die Säure wurde mit einem Eppendorf-Konzentrator über Nacht verdampft und die Pellets wurden in 200 µl in entionisiertem Wasser resuspendiert und zur weiteren Analyse geschickt.

Für die Aminobuttersäureanalyse wurde C. novyi-NT über Nacht in einer anaeroben Kammer von Plas Labs in 5 ml BHI-10 % FBS-Medium gezüchtet. 100 Mikroliter der Übernachtkultur wurden auf einer BHI-FBS-Agarplatte ausplattiert, während die Kontrollplatten mit BHI-10 % FBS-Medium ausgestrichen wurden. Die Kolonien wurden am nächsten Tag mit 1× PBS (500 µl) geerntet. Die Lösungen wurden bei 5000 rcf, 5 Min. und 4 °C unter Verwendung einer Beckman Coulter Microfuge 22R-Zentrifuge zentrifugiert. Das Pellet wurde in 50 % Acetonitril resuspendiert und mit dem Biospec Mini Bead Beater 24 (3500 Umdrehungen/Min., 1 Min., 4 Mal) homogenisiert. Die Proben wurden dann 10 Minuten lang bei 4 °C und 16.000 rcf zentrifugiert. Die Überstände wurden gefriergetrocknet und in 10 % Acetonitril resuspendiert und zur weiteren Analyse geschickt.

Für Norvalin- und Valin-Analysen wurde C. novyi-NT über Nacht in einer anaeroben Kammer von Plas Labs in 5 ml BHI-10 % FBS-Medium gezüchtet. Die Kulturen wurden bei 4700 rcf, 5 Min. und 4 °C unter Verwendung einer Thermo Scientific Sorvall ST 40R-Zentrifuge zentrifugiert und der Überstand zur weiteren Analyse gesammelt. Das Pellet wurde in 50 % Acetonitril resuspendiert und mit dem Biospec Mini Bead Beater 24 (3500 Umdrehungen/Min., 1 Min., 4 Mal) homogenisiert. Die Proben wurden dann 10 Minuten lang bei 4 °C und 16.000 rcf zentrifugiert. Die Überstands-, Pellet- und Medienkontrollproben wurden gefriergetrocknet und in 10 % Acetonitril (Pellet) oder Wasser (Überstands- und Medienkontrolle) resuspendiert und zur weiteren Analyse geschickt.

C. novyi-NT-Sporen wurden in 91,5 mM (Endkonzentration mit Sporen) L-Cystein, L-Alanin, L-Valin, D-Valin und Wasser, das das Enzym Oxyrase (1:50 v/v) enthielt, 30 Minuten lang zum Keimen gebracht 37 °C. Nach 30 Minuten wurden die gekeimten Sporen 5 Minuten lang bei 3900 rcf pelletiert und der Überstand jeder Probe zur weiteren Analyse geschickt.

Alle Peptidoglycan-Extrakte, Metabolitenextrakte und Überstandsproben wurden mit einem Agilent 6546 LC/Q-TOF-Gerät auf einer Phenomenex, Synergi 4 µm Fusion-RP 80 A°-Säule unter Verwendung von Acetonitril und 10 mM Ammoniumformiat/0,1 % Ameisensäure mobil analysiert Phasengradient. Die Proben wurden mit o-Pthaldialdehyd und N-Acetylcystein in Methanol (10 %)-Natriumtetraborat-Puffer derivatisiert. Die LC-MS-EIC-Spektren wurden mit MassHunter Software (Agilent, B.08.00) und Microsoft Excel analysiert.

DOE-Experimente wurden zweimal mit zwei eingebetteten technischen Replikaten wiederholt. Einzelfaktor-Sporenkeimungstests wurden mit 4 biologischen Replikaten durchgeführt, mit Ausnahme von Abb. 1c, wo ein biologisches Replikat für L-Asparagin ausgeschlossen wurde, da es sich um einen klaren Ausreißer handelte. Die Kriterien für die Erkennung von Ausreißern wurden vorab wie folgt festgelegt: [xi − median(xi)]/(Median aller absoluten Abweichungen vom Median) bei einem Grenzwert von 2,5. Das Einbeziehen des Ausreißers ändert nichts am Ergebnis des Experiments. Für jedes Keimungsexperiment wurden mehr als 3,2 × 108 KBE/ml Sporen verwendet, während für die LC-MS-Experimente Sporen in der Größenordnung von 109 KBE/ml verwendet wurden. Dies liegt weit über einem Betrag, der aufgrund einer Unterabtastung zu Fehlern führen könnte. Die statistischen Analysen für die kombinatorischen Experimente (ANOVA) wurden mit der Minitab 20-Software durchgeführt, während die gleichen für die Einzelfaktorexperimente (Student-T-Test ungepaart) mit GraphPad Prism v8.4.3 mit den genauen p-Werten aus der Ergänzungstabelle 5 durchgeführt wurden Die Mittelwerte mit Standardabweichungen wurden ebenfalls mit GraphPad Prism v8.4.3 berechnet. Für jede Bedingung wurden repräsentative LC-MS-Spektren anhand von mindestens zwei unabhängigen Proben ermittelt. Repräsentative Bilder wurden auf der Grundlage von mindestens zwei unabhängigen Proben erhalten.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel (und seinen ergänzenden Informationsdateien) enthalten. Quelldaten für die Abbildungen finden Sie unter „Supplementary Data“.

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Wir möchten Dr. Steven Yuan vom CMMAC-Labor der National University of Singapore für die LC-MS-Analyse danken. Diese Arbeit wurde von Temasek Life Sciences Laboratory Core Funding (http://www.tll.org.sg) (an IC) unterstützt. Der Geldgeber spielte keine Rolle bei der Gestaltung der Studie, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Erstellung des Manuskripts.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Mai Le Ngoc, Marvell Ung Wew, Varsha Ramkumar.

Temasek Life Sciences Laboratory, Singapur, Singapur

Ajitha Sundaresan, Prahlad Raninga, Rongji Sum und Ian Cheong

Abteilung für Biowissenschaften, National University of Singapore, Singapur, Singapur

Ajitha Sundaresan, Rongji Sum und Ian Cheong

NUS High School of Mathematics and Sciences, Singapur, Singapur

Mai Le Ngoc, Marvell Ung Wew und Varsha Ramkumar

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Konzeptualisierung (AS und IC). Datenkuration (AS, LNM, MWU, VR und IC). Formale Analyse (AS, LNM, MWU, VR und IC). Fördermittelakquise (IC). Untersuchung (AS, LNM, MWU, VR, PR und RS). Methodik (AS und IC). Projektverwaltung (AS). Software (IC). Aufsicht (AS und IC). Validierung (AS). Visualisierung (AS und IC). Schreiben – Originalentwurf (AS und IC). Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten (AS, LNM, MWU, VR, PR, RS und IC).

Korrespondenz mit Ian Cheong.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Yuting Ma und Gene Chong.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Sundaresan, A., Le Ngoc, M., Wew, MU et al. Ein Design-of-Experiment-Screening zeigt, dass die Sporenkeimungserkennung von Clostridium novyi-NT für Valin und seine Analoga stereoflexibel ist. Commun Biol 6, 118 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04496-9

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Eingegangen: 07. Juni 2022

Angenommen: 17. Januar 2023

Veröffentlicht: 28. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04496-9

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