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May 31, 2023

Entwicklung eines Umweltkreislaufs

Parasiten und Vektoren

Parasites & Vectors Band 16, Artikelnummer: 78 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Globale Veränderungen verändern die Verbreitung vektorübertragener Krankheiten, indem sie Vektoren in bisher nicht endemische Gebiete verbreiten. Seit 2013 ist die urogenitale Bilharziose auf Korsika aufgetreten und bedroht europäische Länder. Schneckenvektoren setzen Schistosomenlarven frei, die Menschen infizieren können, die mit Süßwasserkörpern in Kontakt kommen. Die Überwachung von Bilharziose-Wirtsvektoren ist eine Voraussetzung, um diese Krankheitserregerübertragung zu verstehen und anschließend zu kontrollieren. Da malakologische Untersuchungen zeitaufwändig sind und besondere Fachkenntnisse erfordern, ist der Einsatz einer einfachen molekularen Methode wünschenswert.

Ziel dieser Studie ist die Entwicklung eines gebrauchsfertigen Protokolls unter Verwendung der LAMP-Methode (Loop-mediated isothermal amplification) zum Nachweis der Umwelt-DNA von Bulinus truncatus, dem Vektor von Schistosoma haematobium. Interessanterweise verfügt die LAMP-Methode über alle Eigenschaften, die für die Anpassung an Feldbedingungen, insbesondere in Ländern mit niedrigem Einkommen, erforderlich sind: Geschwindigkeit, Einfachheit, lyophilisierte Reagenzien, niedrige Kosten und Robustheit gegenüber DNA-Amplifikationsinhibitoren. Wir haben diese neue Methode an korsischen Wasserproben getestet, die zuvor mittels qPCR und ddPCR analysiert wurden.

Wir zeigen, dass unser Diagnosetool B. truncatus eLAMP (Bt-eLAMP) die eDNA von Bulinus truncatus genauso effektiv erkennen kann wie die beiden anderen Methoden. Bt-eLAMP kann sogar 1/4 der positiven Proben erkennen, die durch qPCR nicht nachweisbar sind. Darüber hinaus erfordert das vollständige Bt-eLAMP-Protokoll (Probenahme, Probenvorverarbeitung, Amplifikation und Offenlegung) keine hochentwickelte Ausrüstung und kann in 1 ½ Stunden durchgeführt werden.

Der LAMP-Nachweis von Umwelt-DNA ermöglicht eine umfassende, empfindliche Überwachung der urogenitalen Bilharziose, indem potenziell gefährdete Bereiche identifiziert werden. Generell hat die eLAMP-Methode großes Potenzial für durch Vektoren übertragene Krankheiten und die Ökologie.

Es ist allgemein bekannt, dass globale Veränderungen das Risiko von Ausbrüchen von Infektionskrankheiten erhöhen [1,2,3]. Die aufeinanderfolgenden Epidemiewellen im letzten Jahrzehnt wie die Schweinegrippe-Pandemie, zahlreiche Ebola-Virus-Ausbrüche in Westafrika, der Zika-Virus-Ausbruch 2015 und die COVID-19-Pandemie führten alle zu erheblicher Mortalität und Morbidität und breiteten sich auf mehrere Länder aus [2]. Die Häufigkeit vektorübertragener Krankheiten bei Menschen und Tieren wird durch den Klimawandel und den menschlichen Lebensstil (z. B. Migration, Umweltverschmutzung, Urbanisierung) beeinflusst [1, 4, 5]. Viele von ihnen tauchen seit mehreren Jahren weltweit auf oder tauchen wieder auf. Beispielsweise nehmen die geografische Verbreitung des durch Zecken übertragenen Enzephalitis-Virus und die Inzidenz beim Menschen in ganz Europa, einschließlich Frankreich, in Gebieten zu, die zuvor nicht endemisch waren [6]. Obwohl Bilharziose eine Krankheit ist, die mit Armut und Trinkwassermangel in Haushalten einhergeht, wurde in Südeuropa (Frankreich und Spanien) eine Schistosomeninfektion festgestellt [7, 8]. Schneckenvektoren setzen Schistosomenlarven frei, die Menschen infizieren können, die mit Süßwasserkörpern in Kontakt kommen. Im Sommer 2013 wurden auf Korsika, einer französischen Mittelmeerinsel, die für ihre touristische Attraktivität bekannt ist, > 106 Fälle diagnostiziert [9, 10]. Seitdem kam es Jahr für Jahr zu einigen wenigen Fällen autochthoner Übertragung [11]. Bei vielen parasitären Krankheiten führen globale Veränderungen zu einer räumlichen Umverteilung der Vektoren oder Zwischenwirte, die die Krankheiten übertragen, und können auch zur Entstehung von Krankheiten führen [12,13,14,15,16]. Die Kartierung von Ausbruchsgebieten von Infektionskrankheiten ist von wesentlicher Bedeutung, um sowohl infektionsgefährdete Bevölkerungsgruppen zu identifizieren als auch die Öffentlichkeit zu informieren und zu warnen [17]. Bei vektorübertragenen Krankheiten ist die Kartierung ihrer räumlichen Verteilung für die Krankheitsbekämpfung erforderlich, da die Übertragung von der Anwesenheit der Vektoren abhängt. In mehreren afrikanischen Ländern wurde gezeigt, dass Kampagnen zur Schneckenbekämpfung eine wichtige Rolle bei der Bekämpfung von durch Schnecken übertragenen Krankheiten (SBDs) spielen und dass die regelmäßige Anwendung von Molluskiziden wahrscheinlich zur Eliminierung der SBDs in Risikogebieten beiträgt [18,19,20 ]. Allerdings ist die Überwachung von SBDs, insbesondere solchen, die über Süßwasserschneckenarten übertragen werden, weniger offensichtlich. Die räumliche und zeitliche Heterogenität der Verbreitung von Süßwassermollusken erklärt die Schwierigkeit, diese Risikokarten zu erstellen [21, 22]. Herkömmliche Probenahmemethoden sind daher mühsam und zeitaufwändig und erfordern für die taxonomische Identifizierung Malakologen, die in den letzten Jahren mit dem Aufschwung der Molekularbiologie immer seltener geworden sind. Daher ist es derzeit sehr schwierig, Schneckenpopulationen in einem großen räumlichen und zeitlichen Maßstab zu überwachen [21, 22].

Um dieses Problem anzugehen, wurde die Entwicklung von Instrumenten zur Vereinfachung der Überwachung von SBDs in Betracht gezogen, die auf Umwelt-DNA (eDNA) basieren [23]. eDNA-Amplifikationsmethoden wurden entwickelt, um viele Parasitenvektoren wie Aedes albopictus (24) und auch Schneckenwirte wie Galba truncatula und Austropeplea tomentosa (25, 26) nachzuweisen, wobei beide Arten an der Übertragung des Leberegels (Fasciola hepatica) beteiligt sind. Der Nachweis von eDNA erfolgt üblicherweise mithilfe der quantitativen PCR-DNA-Amplifikationstechnik. In jüngerer Zeit wurde der eDNA-Nachweis von Oncomelania hupensis und Bulinus truncatus, die an der Übertragung von Schistosoma japonicum bzw. Schistosoma haematobium beteiligt sind, entweder durch quantitative PCR (qPCR) oder digitale Tröpfchen-PCR (ddPCR) ermöglicht [21, 27]. Die in diesen letzten Studien erzielten Ergebnisse zeigten einen Nachweis mit hoher Empfindlichkeit und Spezifität. Der Nachweis von B. truncatus-eDNA mittels ddPCR ermöglichte den Nachweis von bis zu 0,06 Kopien/µl [21]. Dies stellt einen erheblichen Fortschritt in der Entwicklung von Tools zur Vereinfachung der SBD-Überwachung dar. Alle diese Techniken erfordern jedoch hochentwickelte und teure Ausrüstung sowohl für die Probenvorbereitung (d. h. die Verwendung teurer und zeitaufwändiger DNA-Extraktionskits, um eDNA ohne PCR-Inhibitoren zu erhalten) als auch für Amplifikationsgeräte (d. h. LightCycler oder ddPCR). Diese kostspieligen Techniken erfordern ein gut ausgestattetes Labor, das in Schistosomen-Endemiegebieten selten verfügbar ist. Die Entwicklung kostengünstiger und feldangepasster Werkzeuge zur Erstellung von Schneckenverbreitungskarten ist weiterhin erforderlich [17, 23, 28]. Die Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP)-Technik hat das Potenzial, dies zu ermöglichen [29,30,31]. Interessanterweise verfügt die LAMP-Methode über alle Eigenschaften, die für die Anpassung an Feldbedingungen, insbesondere in Ländern mit niedrigem Einkommen, erforderlich sind: Geschwindigkeit, Einfachheit, lyophilisierte Reagenzien, niedrige Kosten und Robustheit gegenüber DNA-Amplifikationsinhibitoren (29, 30, 32). Tatsächlich kann die exponentielle DNA-Amplifikationsreaktion unter Verwendung eines Bst-Polymerase-Enzyms mit Strangverdrängungsaktivität und vier bis sechs Primern, die an sechs bis acht Regionen der Zielsequenz hybridisieren, bei konstanter Temperatur und ohne vorherige Denaturierung der DNA-Doppelstränge durchgeführt werden. Tatsächlich erzeugt die Hybridisierung der Primer Stamm-Schleifen-Strukturen auf den neu amplifizierten Strängen, was zu einer exponentiellen Vervielfachung der Anzahl neuer Amplifikationsstartzonen führt. Schließlich erhalten wir einen Ausstrich, der aus mehreren Fragmenten unterschiedlicher Größe besteht, die nach der Entdeckung durch Elektrophorese-Gel eine Leiter bilden. Daher läuft die Reaktion sehr schnell (normalerweise < 1 h) bei einer konstanten Temperatur von etwa 63 °C in einem einfachen Heizblock ab [29, 31, 33]. Da für die Durchführung einer LAMP keine große oder teure Ausrüstung erforderlich ist, haben sich neuere Studien auf die Entwicklung tragbarer Geräte konzentriert, um Felddiagnosen so nah wie möglich an der Probenahmestelle durchzuführen [34,35,36,37]. Aufgrund seiner Robustheit gegenüber Inhibitoren kann es an Proben mit sehr vereinfachter Vorbereitung durchgeführt werden, ohne dass DNA-Extraktionskits zur Reinigung der DNA erforderlich sind, was auch vor Ort durchgeführt werden kann [38, 39]. Die DNA-Amplifikation kann durch Visualisierung mit bloßem Auge, Gelelektrophorese oder Echtzeit-Fluoreszenz nachgewiesen werden, was eine flexible Nutzung im Feldeinsatz bietet [34, 36]. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass es möglich ist, eDNA durch LAMP nachzuweisen [40,41,42,43]. Eine Umgebungslampe (eLAMP) wurde entwickelt, um das Vorhandensein von Fäkalienindikatorbakterien im Wasser innerhalb einer Stunde nachzuweisen, ohne dass hochentwickelte Laborgeräte oder hochqualifiziertes Personal erforderlich sind [40]. Zwei Teams gelang es, Mollusken-eDNA (Galba truncatula und Dreissena sp.) aus Wasserproben mit LAMP zu amplifizieren [41, 42].

Das Ziel dieser Studie ist die Entwicklung eines schnellen diagnostischen LAMP-Tools zum Nachweis der Umwelt-DNA von Bulinus truncatus, einem Zwischenwirt von Schistosoma haematobium. Schistosomiasis ist nach Malaria die zweithäufigste parasitäre Erkrankung und nach wie vor eine vernachlässigte Tropenkrankheit. Trotz der hohen Inzidenz (230 Millionen Infizierte und 200.000 Todesfälle pro Jahr [44]) sind die Bemühungen zur Durchführung von Kampagnen zur Schneckenbekämpfung sehr gering [28, 45, 46]. Im Jahr 2017 forderte die WHO jedoch eine erneute Fokussierung auf die Schneckenbekämpfung, um den Fortschritt aufrechtzuerhalten, und forderte die Mitgliedstaaten auf, nationale Vektorkontrollstrategien zu entwickeln oder anzupassen, mit dem Ziel, die Inzidenz vektorübertragener Krankheiten, einschließlich Schistosomiasis, bis 2025 um mindestens 40 % zu reduzieren [46]. Daher sind für diese Krankheit kostengünstige, feldgerechte Instrumente zur schnellen Kartierung der Schneckenverteilung erforderlich [23]. Im Vergleich zu qPCR- oder ddPCR-Amplifikationsmethoden scheint eLAMP hinsichtlich der Feldeinsetzbarkeit in Ländern mit niedrigem Einkommen vorteilhaft zu sein. Dieser Vorteil geht jedoch verloren, wenn das der Amplifikation vorangehende DNA-Extraktionsprotokoll nicht an die Feldbedingungen angepasst wird, wie z. B. bei der Verwendung von DNA-Extraktionskits. Unsere Arbeit bestand aus (i) der Entwicklung eines B. truncatus-spezifischen eLAMP-Assays, (ii) dem Vergleich der von LAMP auf einer eDNA-Bank erhaltenen Ergebnisse mit denen von qPCR und ddPCR und (iii) der Entwicklung eines vollständigen feldfreundlichen Protokolls der Erkennung.

Das Diagnosetool Bulinus truncatus eLAMP (Bt-eLAMP) wurde sowohl auf der Grundlage einer Umwelt-DNA-Bank (eDNA) als auch neu extrahierter DNA aus Weichtieren entwickelt.

Die eDNA-Bank besteht aus 200 Proben, die zuvor auf der Insel Korsika in Frankreich gesammelt wurden [21]. Bei diesen Proben handelte es sich um DNA, die aus Wasserfiltrationsmembranen extrahiert wurde, die in zwei verschiedenen Flüssen im Süden Korsikas gesammelt wurden. In diesen beiden Flüssen wurde kürzlich eine Übertragung der urogenitalen Schistosomiasis nachgewiesen [9, 10, 47]. Es wurden drei unterschiedliche Wassermengen (1, 3 und 5 l) sowohl vom Ufer als auch aus den Bachbetten der Flüsse gesammelt. Im Cavu-Fluss wurden vier Standorte beprobt: die Standorte Mulinu-Brücke und Tyroliana-Park (in zweifacher Ausfertigung beprobt), der Standort mit den drei Becken, an dem B. truncatus vorhanden ist, und die Wassereinlassstelle, an der B. truncatus nicht vorhanden ist. Am Solenzara-Fluss wurde eine einzige Stelle beprobt, an der B. truncatus vorkommt. Negativkontrollen wurden durchgeführt, indem reines Quellwasser entlang des Flusses gefiltert wurde. Zusätzlich zu diesen Probenahmestellen auf Korsika wurde als Negativkontrolle auch eDNA aus einem künstlichen Kanal auf dem Campus der Universität Perpignan entnommen, wo B. truncatus nie nachgewiesen wurde. Das eDNA-Extraktionsprotokoll aus den resultierenden Wasserfiltrationsmembranen wurde zuvor beschrieben [21] und wird hier kurz in Erinnerung gerufen: Jede Filtrationsmembran wurde in vier Viertel geteilt und mit dem DNeasy® Blood & Tissue Kit (QIAGEN) extrahiert. Von den 200 Proben wurden 144 eDNA-Proben gesammelt, in denen B. truncatus vorhanden war, und 56 eDNA-Proben, in denen B. truncatus nicht vorhanden war, und sie wurden mithilfe von qPCR amplifiziert. Eine Probe galt als positiv, wenn mindestens ein Viertel der Membran positiv war. Die ddPCR-Reaktionen wurden an Pools von DNA-Extrakten aus den vier Vierteln jeder Membran durchgeführt (dh 50 Reaktionen) [21]. Die mit qPCR und ddPCR erzielten Ergebnisse pro Membran wurden mit eLAMP (vorliegende Studie) verglichen. Die durch qPCR erhaltenen Ergebnisse pro Membranviertel wurden auch mit eLAMP verglichen.

Zusätzlich zu eDNAs und um die Spezifität unserer Primer-Sets zu testen, wurde auch DNA aus Süßwasserschnecken (Bulinus sp. und anderen phylogenetisch verwandten Gattungen) mit dem DNeasy® Blood & Tissue Kit (QIAGEN) gemäß dem Gewebeextraktionsprotokoll extrahiert. Kurz gesagt, nach dem Mahlen jeder Schnecke wurden die Proben 20 Minuten lang bei 65 °C in einen Speedvac™ DNA 130 (Savant™, Thermo Scientific™) gegeben, um etwaige Alkohol- oder Wasserrückstände zu entfernen. Anschließend wurden die Schnecken 4 Stunden lang bei 56 °C in einer Lösung mit 20 ml Proteinase K und 180 ml ATL-Puffer lysiert. Die restlichen Schritte wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die DNA-Konzentration wurde mit einem Qubit® 2.0 Fluorometer gemessen. Diese letzten DNAs wurden mit hochreinem Wasser verdünnt, um Endkonzentrationen von 0,5 ng/µl zu erhalten. Die resultierenden DNA-Extrakte und Verdünnungen wurden dann bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert.

Die Auswahl der DNA-Ziele war umfassend, um die Erfolgsaussichten bei der Entwicklung des eLAMP-Diagnosetools zu maximieren. Der ITS2; 5,8S; 18S; COI; und 28S B. truncatus-DNA-Regionen wurden aus der GenBank-Datenbank heruntergeladen (NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/; Zugangsnummern: MH361757 für 5,8S; KJ157340 für 18S [48]; KJ157370 für 28S [48]; MT707426 für COI [49] und MG757890 für ITS2 [50]). Sofern verfügbar, wurden Sequenzen anderer Bulinus-Arten aus der GenBank-Datenbank heruntergeladen, um ein B. truncatus-spezifisches Erkennungstool zu entwickeln. Das Design der Primersätze wurde mit der Software Primer Explorer V5 (Eiken Chemical Co., Ltd., Japan; http://primerexplorer.jp/e/) gemäß den in „A Guide to LAMP primer designing“ (https://primerexplorer.jp/e/) beschriebenen Kriterien durchgeführt ://primerexplorer.jp/e/v5_manual/index.html). Die Sätze mussten die folgenden Parameter erfüllen: Länge jedes Primers zwischen 18 und 22 bp; Tm zwischen 64 und 67 °C für das F1c/B1c-Paar; Tm zwischen 59 und 62 °C für F2/B2- und F3/B3-Paare; GC-Rate zwischen 50 und 65 %; dG-Schwellenwert < –4 kcal/mol für 5'- und 3'-Stabilität und zwischen 0 und –1 kcal/mol für die Dimerprüfung. Die Schätzung des Primerdimers und die Stabilität jedes Primersatzes wurden online mit dem „Multiple Primer Analyzer“ (Thermo Scientific Web Tool) und dem OligoAnalyzer™ Tool (IDT™) überprüft. Alle ausgewählten Primer wurden von Eurogentec (Seraing, Belgien) synthetisiert.

Für jeden entworfenen Primersatz wurden mehrere Amplifikationstests durchgeführt, indem die Parameter der Amplifikationsreaktion angepasst wurden (dh MgSO4, Primer- und Betainkonzentration, Reaktionszeit und Temperatur). Das ausgewählte Protokoll war wie folgt: ein Gesamtvolumen von 10 µl, enthaltend 1,2 µM der internen Primer FIP und BIP, 0,2 µM der externen Primer F3 und B3, 0,4 µM der LOOP-Primer LB und LF, 1,0 mM jedes dNTP ( New England Biolabs), 1X Isothermal Amplification Buffer II Reaktionspuffer [20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH4)2SO4, 150 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0,1 % Tween® 20, pH 8,8 bei 25 °C (Neu England Biolabs, UK)], 3 mM zusätzliches MgSO4 (New England Biolabs, UK), 1,2 M Betain und 1 U Bst 2.0 WarmStart DNA-Polymerase (New England Biolabs, UK) zusammen mit 2,5 µl DNA-Vorlage. Die Reaktionsröhrchen wurden 45 Minuten lang in einem batteriebetriebenen Heizblock bei 63 °C platziert, gefolgt von einer Enzyminaktivierungsphase bei 80 °C für 5 Minuten, wenn die Ergebnisse nicht unmittelbar nach der Reaktion sichtbar waren. Die Visualisierung der Ergebnisse erfolgte nach verschiedenen Protokollen, die klassischerweise bei der LAMP-DNA-Amplifikation verwendet werden: (i) visueller Endpunktnachweis der Fluoreszenz nach Zugabe von 2 μl 1:50 verdünnter 10.000-facher Konzentration von SYBR Green (Invitrogen) (grün: positiv; orange: negativ). ); (ii) visueller Endpunktnachweis der LAMP-Produkte auf einer 2 %igen Agarosegelelektrophorese mit 2 µl MIDORI Green Advance (Nippon Genetics) für 50 ml Agarosegel, sichtbar durch UV-Strahlung; (iii) Echtzeit-Detektion durch Einarbeitung von Sybr-Green 0,25× in die Reaktionsmischung und Überwachung der Amplifikation in einem tragbaren Genie III-Gerät (Optigene Ltd).

Die Spezifität aller entworfenen Primersätze wurde anhand von DNA-Vorlagen von 12 Süßwasserschneckenarten (Tabelle 1) bewertet, darunter vier Exemplare derselben Gattung, aber verschiedener Arten (d. h. B. forskalii, B. globosus, B. umbilicatus und B. senegalensis). und andere phylogenetisch verwandte Gattungen. Bulinus truncatus aus fünf verschiedenen Fundorten (Tabelle 1) wurde ausgewertet, um eine mögliche intraspezifische Variabilität zu visualisieren. Für die folgenden Experimente wurde nur der Primersatz aufbewahrt, der ausschließlich B. truncatus-DNA amplifizierte.

Die Nachweisgrenze (LOD) wurde durch LAMP-Assays an DNA von B. truncatus zehnfach seriell verdünnt von 10 ng/µl auf 1,10–9 ng/µl vor und nach Zugabe von LOOP-Primern zur Reaktion ermittelt. Aus der ermittelten DNA-Konzentration an der Nachweisgrenze wurde die Anzahl der B. truncatus-Zielkopien pro Mikroliter mithilfe der folgenden Gleichung geschätzt:

wobei Nc = die Anzahl der B. truncatus-Zielkopien pro Mikroliter; C = Grenznachweis-DNA-Konzentration in ng/µl; V = Volumen (hier 1 µl); M = durchschnittliche Molmasse einer stickstoffhaltigen Base = 309 g/mol; Sg = B. truncatus-Genomgröße = 1,2.109 pb; NA = Avogadro-Zahl; NrDNA = durchschnittliche rDNA-Kopienzahl in einem Genom = 93 Kopien [51,52,53,54,55,56].

Wir haben ein neues feldfreundliches eDNA-Konzentrationsprotokoll entwickelt, das es uns ermöglicht, die Feldvorteile von LAMP voll auszunutzen. Das Wasser wird in einer sauberen handelsüblichen Plastikflasche auf der Oberfläche des Gewässers gesammelt. Anschließend werden 500 ml bis 1500 ml Wasser mithilfe einer 0,45-µm-Filtereinheit (PES VWR 1L 514-0301) und einer manuellen Pumpe entlang des Flusses gefiltert. Das Wasser wird gefiltert, bis die Membran durch Sedimentablagerungen verstopft ist. Die Membran wird mit einer Skalpellklinge in vier Viertel geschnitten und in ein einzelnes 25-ml-Falcon™-Röhrchen mit 15 ml Lysepuffer [100 mM NaCl, 250 mM EDTA, 5 % SDS und 10 mM Tris-HCl (pH = 8)“ gegeben. ]. Klammern, die zum Entfernen der Membranen aus Filtrationseinheiten verwendet werden, werden vor jeder Probenahme dekontaminiert, indem sie nacheinander 15 Sekunden lang in ein 10 %iges Bleichbad und dann 15 Sekunden lang in eine DNA AWAY™-Lösung (Thermo Scientific) gelegt werden. Nach kräftigem Rühren wird die Flüssigkeit mit einer 20-ml-Spritze aufgefangen. Die Flüssigkeit wird mit einer 40-µm-Membran vorgefiltert, um größere Sedimente zu entfernen, und dann mit einem 0,45-µm (13-mm) Whatman® GD/XP-Spritzenfilter (PTFE Sigma Aldrich WHA69742504) gefiltert. Der letzte Filter wird mit 5 ml destilliertem Wasser gewaschen und mit der gleichen Luftmenge getrocknet. Die eDNA wird schließlich durch Rückfiltration mit 500 µl Reinstwasser mithilfe einer Spritze und einer konischen 18-GA-Dosiernadel (Metcal) gewonnen.

Dieses letzte Protokoll wurde in zwei senegalesischen Gewässern bewertet, die im Juli 2022 untersucht wurden. Der Standort Lampsar (16°06′29′′N; 16°20′59′′W) und der Standort Diama (16°12′36′′N; 16°24′10′′W) liegen beide am Fluss Senegal in der Region Saint-Louis, Senegal. An jedem Standort wurden Wasserproben in dreifacher Ausfertigung mit einem Abstand von etwa 10 m zwischen den Proben entnommen. Für die Standorte Lampsar und Diama wurden jeweils 700 Milliliter, zweimal 500 ml und dreimal 500 ml gesammelt. An jedem Standort wurden Negativkontrollen durchgeführt, indem 1500 ml reines Quellwasser streng nach dem gleichen Verfahren wie bei biologischen Proben gefiltert wurden. Das Vorhandensein von B. truncatus vor Ort wurde durch einstündige Probenahme von Weichtieren durch zwei Malakologen bestätigt.

Die Übereinstimmung zwischen den Ergebnissen, die mit dem neu entwickelten LAMP und dem qPCR zum Nachweis von B. truncatus-DNA in der 200-Felder-eDNA-Bibliothek erzielt wurden, wurde statistisch analysiert, indem eine Kappa-Koeffizientenanalyse unter Verwendung des Psych-Pakets (Version 2.2.9) in der R-Software berechnet wurde. Die Feldsensitivitäten der eDNA-Bank wurden mit einem Konfidenzintervall von 95 % unter Verwendung des Statistikpakets (Version 3.6.2) in der R-Software berechnet.

Insgesamt wurden 18 Primer-Sets entworfen. Nach Parameteranpassung und Sensitivitäts- und Spezifitätsbewertung haben wir den besten Kandidaten ausgewählt, der auf den ITS2-Marker abzielt (Tabelle 2). Eine zusätzliche Datei zeigt die Primerausrichtung auf der ITS2-Sequenz (siehe zusätzliche Datei 1). Primer-Dimer-Mindest-dG dafür eingestellt war –0,93 kcal/mol.

Die Bt-eLAMP-Spezifität wurde durch Testen der extrahierten DNA von 11 nicht gezielten Arten und fünf gezielten Weichtieren aus verschiedenen Fundorten bewertet. Abbildung 1a zeigt, dass nur die fünf B. truncatus-DNA-Proben amplifiziert werden. Der Empfindlichkeitstest (Abb. 1b) zeigt, dass der LOD bei vollständigem Primersatz (einschließlich LOOP-Primer) 1 fg/µl beträgt (dh entspricht etwa Nc = 0,07 Kopien pro Mikroliter). Die Nachweisgrenze lag vor der Zugabe der LOOP-Primer bei 1 pg/µl.

Spezifität und LOD (Nachweisgrenze) des Bulinus truncatus eLAMP (Bt-eLAMP)-Assays. Ergebnisse der Agarosegelelektrophorese nach 45-minütiger Reaktion. eine Besonderheit; Spuren 1–5, Bulinus truncatus-DNA-Vorlagen aus fünf verschiedenen Fundorten (Diama, Lampsar, Mbane, Korsika und Saneinte); Spur 6, Bulinus globosus; Spur 7, Bulinus senegalensis; Spur 8, Bulinus forskalli; Spur 9, Bulinus umbilicatus; Spur 10, Biomphalaria glabrata; Spur 11, Bithynia tentaculata; Spur 12, Ancylus fluviatilis; Spur 13, Gyraulus laevis; Spur 14, Physa acuta; Spur 15: Potamopyrgus antipodarum; Spur 16, Pisidium casertanum; Spur C +, Positivkontrolle (Bulinus truncatus-DNA; 1 ng); Spur C-, Negativkontrolle (Wasser als Vorlage). b LOD; Spur 1–11: Zehnfache Reihenverdünnungen der Bulinus truncatus-DNA (10 ng/μl bis 1 Ag/μl); Spur C-, Negativkontrolle (Wasser als Vorlage)

Abbildung 2 zeigt den Vergleich der Nachweisgenauigkeit zwischen LAMP-, qPCR- und ddPCR-Amplifikationsmethoden an eDNA-Proben, die aus zwei korsischen Flüssen entnommen wurden. Die Bt-eLAMP-Methode lieferte die gleichen Ergebnisse wie die qPCR und ddPCR. Alle Membranen sind positiv, mit Ausnahme der „1LStreambed“-Membran vom Standort Mulinu Bridge Two. Bei den sechs Feld-Negativkontrollen oder am Universitätsstandort, wo B. truncatus nie vorkam, oder bei Proben, die an der Wasserentnahmestelle des Flusses Cavu gesammelt wurden, wo kein B. truncatus gesammelt wurde, wurde kein positives Signal festgestellt (Abb. 2). Unter Berücksichtigung der Ergebnisse pro Membranviertel, in dem B. truncatus vorhanden war, wurden 110 von 144 Proben erfolgreich mit LAMP amplifiziert; Mittlerweile wurden 91 von 144 Proben erfolgreich mit qPCR amplifiziert. Die Sensitivität der LAMP- und qPCR-Methoden wurde auf 76,4 % (95 %-KI 68,6–83,1) bzw. 63,2 % (95 %-KI 54,8–71,1) geschätzt. Die mit diesen Ergebnissen erzielte Kappa-Übereinstimmung beträgt 0,51 (Tabelle 3).

Vergleich des Nachweises von Bulinus truncatus-DNA aus der Umgebung durch Schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP), quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) und digitale Tröpfchen-Polymerase-Kettenreaktion (ddPCR)-Amplifikationsmethoden. Jede Zelle stellt DNA-Amplifikationsergebnisse von eDNA dar, die in zwei korsischen Flüssen (Cavu und Solenzara) und im Perpignan-Kanal gesammelt wurden; Bulinus truncatus-Schnecken kommen an allen Standorten vor, mit Ausnahme der Wasserentnahmestelle im Cavu-Fluss und der Universitätsstelle im Perpignan-Kanal. An allen korsischen Standorten wurden drei Wassermengen (1, 3 und 5 l) sowohl vom Ufer als auch aus den Flussbetten der Flüsse gesammelt. Jede Linie stellt das Amplifikationsergebnis jeder Stelle unter Verwendung der LAMP-, qPCR- oder ddPCR-Amplifikationsmethode dar. qPCR- und ddPCR-Ergebnisse stammen von Mulero et al. [21]. Eine grüne Membran bedeutet, dass mindestens ein Viertel der Filtrationsmembran positiv für das Vorhandensein von Bulinus truncatus ist, und eine rote Membran bedeutet, dass kein Viertel der Filtrationsmembran positiv ist. Leere Zellen bedeuten, dass unter diesen Bedingungen keine Filtration durchgeführt wurde

Der Einsatz der LAMP-Amplifikation als feldfreundliche Nachweismethode wurde durch die Entwicklung eines neuen eDNA-Konzentrationsprotokolls verbessert, das entlang der Gewässer durchgeführt werden konnte. Das gesamte Protokoll wurde an den Standorten Lampsar und Diama im Senegal getestet. An diesen beiden Standorten wurden jeweils 95 und 229 B. truncatus von zwei Malakologen für eine einstündige Probenahme beprobt. Vier der 95 B. truncatus, die am Standort Lampsar beprobt wurden, emittierten nach 2-stündiger Lichteinwirkung Cercarien. Bulinus globosus war an beiden Standorten vorhanden. Bulinus forskalii kam nur am Standort Diama vor, während wir Biomphalaria pfeifferi nur am Standort Lampsar fanden. Die drei eDNA-Proben von den beiden Standorten waren positiv (Abb. 3) und zeigten eine 100-prozentige Genauigkeit der Methode. Keine der Negativkontrollen war positiv. Proben von B. truncatus-eDNA wurden im Durchschnitt 12 Minuten nach der Amplifikation der Positivkontrollen (aus B. truncatus extrahierte DNA) amplifiziert.

Echtzeit-Loop-vermittelte isotherme Amplifikation von Bulinus truncatus-Umwelt-DNA an den Standorten Diama (a) und Lampsar (b), Senegal. Orange, gelbe und grüne Linien sind getestete Proben. Türkise und blaue Linien sind Positivkontrollen (1 ng extrahierte DNA aus B. truncatus). Die rote Linie ist eine Feldnegativprobe (1500-ml-Filtration von Mineralwasser). Violette und rosa Linien sind Labornegativproben (Reinstwasser)

Globale Veränderungen verändern die Verbreitung vektorübertragener Krankheiten, indem sie Vektoren in bisher nicht endemische Gebiete verbreiten. Daher ist die Entwicklung kostengünstiger und feldangepasster Werkzeuge für Vektorverteilungskarten erforderlich [17, 28]. In der vorliegenden Studie haben wir ein schnelles LAMP-Diagnosetool zum Nachweis der Umwelt-DNA eines Süßwasserschneckenvektors (z. B. B. truncatus) eines tropischen Parasiten (z. B. S. haematobium) entwickelt. Unser Bt-eLAMP amplifizierte erfolgreich eine ITS2-DNA-Markerfraktion von B. truncatus nach 45-minütiger Inkubation bei 63 °C. In-vitro-Assays bewiesen die hohe Empfindlichkeit des Bt-eLAMP mit einer LOD von 1 fg/µl, wenn es LOOP-Primer enthielt. Wenn man bedenkt, dass die LOD vor der Zugabe der LOOP-Primer 1 pg/µl betrug, folgern wir, dass die Zugabe von LOOP-Primern einen Empfindlichkeitsgewinn um den Faktor 1000 ermöglicht. Aus methodischer Sicht unterstreicht dies die Bedeutung der Gestaltung von Primersätzen, die dies zulassen Einbeziehung von LOOP-Primern. Die Nachweisgrenzen der entwickelten LAMP-Techniken liegen im Allgemeinen zwischen 100–0,1 fg/µl [43, 57,58,59]. Unser LOD ist niedriger als der LOD, der zuvor für den LAMP-eDNA-Nachweis des Süßwasserschneckenvektors der Fasziolose (Galba truncatula) bewertet wurde [41]. Diese letzten Autoren haben einen LOD von 0,349 pg/μl gemessen [41]. Bei der Schätzung der Kopienzahläquivalenz (0,07 Kopien pro Mikroliter) mit dem vollständigen Primersatz (dh einschließlich LOOP-Primern) fanden wir eine Empfindlichkeit, die der mit ddPCR (0,06 Kopien pro Mikroliter) erhaltenen Empfindlichkeit nahe kommt [21]. Unser Bt-eLAMP zeigte die gleiche Empfindlichkeit wie die ddPCR, die als die empfindlichste DNA-Amplifikationstechnik überhaupt gilt [60, 61].

Unser Bt-eLAMP-Assay zeigte eine 100-prozentige Spezifität für B. truncatus, selbst unter Berücksichtigung eng verwandter Schneckenarten. Dies deutet darauf hin, dass der Bt-eLAMP-Assay robust genug ist, um B. truncatus-eDNA in Bereichen nachzuweisen, in denen andere Schnecken gleichzeitig vorkommen, ohne dass das Risiko einer Kreuzreaktivität besteht. Unser Tool kann auch die Artenbestimmung zwischen B. truncatus und anderen Bulinus-Arten wie B. globosus ermöglichen, die morphologisch nicht unterscheidbar sind. Andererseits könnte der Nutzen dieser hohen Spezifität in Frage gestellt werden, wenn man bedenkt, dass die Schwesterarten einiger Weichtiere, wie z. B. B. globosus, ebenfalls an der Übertragung der urogenitalen Bilharziose beteiligt sein könnten [62]. Es wäre interessant, auch eDNA-Diagnosetools zu entwickeln, die einen panspezifischen Nachweis sowohl von B. truncatus als auch B. globosus oder allen Arten der Gattung Bulinus ermöglichen. Die Schwierigkeit wird darin bestehen, ein Gleichgewicht zwischen ausreichend konservierten Regionen zwischen Bulinus-Arten und ausreichend unterschiedlichen Regionen zu anderen Gastropoden zu finden, um einen gattungsspezifischen Primersatz zu erhalten. Diese letzte Aufgabe ist schwieriger, da die Anzahl der in LAMP erforderlichen Primer und die Positionierungsbeschränkungen zwischen ihnen auf der Zielsequenz die Länge der zu findenden Sequenz erhöhen, die diese Anforderungen erfüllt.

In Anbetracht unserer eDNA-Bank lieferte die Bt-eLAMP-Methode im Vergleich zur qPCR oder der ddPCR genau die gleiche Gesamtnachweiskapazität [21]. Betrachtet man jedes Membranviertel, so zeigte die LAMP-Methode mit 76,4 % (95 %-KI 68,6–83,1) bzw. 63,2 % (95 %-KI 54,8–71,1) positiver Nachweise mittels LAMP bzw. qPCR eine höhere Nachweiskapazität im Vergleich zur qPCR [21] . Der Kappa-Koeffizient verdeutlicht die mäßige Übereinstimmung zwischen den beiden Methoden. Fünfzehn Membranviertel sind bei LAMP negativ, während sie bei qPCR positiv sind; Umgekehrt sind 34 Membranviertel bei qPCR negativ und bei LAMP positiv. Das Vorhandensein von PCR-Inhibitoren könnte diese letzten Ergebnisse erklären. Tatsächlich konnte bereits nachgewiesen werden, dass LAMP im Gegensatz zur qPCR robust gegenüber Inhibitoren ist [29, 63].

Die Entwicklung feldfreundlicher Amplifikationsmethoden wie LAMP muss mit der Entwicklung eines feldfreundlichen Vorprozesses der Probe einhergehen. Die Verwendung von DNA-Extraktionskits, die aufgrund ihres hohen Reinigungsgrades eine geringe Ausbeute erzielen, erfordert spezielle Geräte wie Zentrifugen, die kostspielig sind. Aus diesem Grund haben wir ein neues feldfreundliches Vorverfahren für Wasserproben entwickelt, um die eDNA zu konzentrieren. Die Probenahme und das Vorverarbeitungsprotokoll wurden in 45 Minuten vor Ort ohne Strom durchgeführt, was einen erheblichen Fortschritt bei der SBD-Überwachung darstellt. Dennoch können an unserem Protokoll mehrere Verbesserungen vorgenommen werden, insbesondere im Schritt der Wasserfiltration. Die verwendete manuelle Pumpe schränkt die Geschwindigkeit und den Komfort des Protokolls ein, da es 30 Minuten pro Probe dauerte, nur 500 ml Wasser mit Schwierigkeiten zu filtern. Eine batteriebetriebene 12-V-Membranwasserpumpe in Verbindung mit einer angepassten Filterkapsel wurde verwendet, um in einer DNA-Untersuchung zu Trematoden im Wasser bis zu 50 l Wasser zu filtern [64]. Um die Praktikabilität und Geschwindigkeit des Bt-eLAMP-Assays weiter zu verbessern, könnte eine verbesserte batteriebetriebene Pumpe die manuelle Pumpe ersetzen. Die Kompatibilität zwischen einer motorisierten Pumpe und den in unserem Protokoll verwendeten Filtereinheiten muss getestet werden.

Um unsere Feldergebnisse aus Senegal zu erhalten, verwendeten wir den Genie III, ein nützliches, leicht zu transportierendes, batteriebetriebenes Feldgerät, das die Visualisierung der Reaktionskinetik ermöglicht. In Verbindung mit gefriergetrockneten Reagenzien ermöglicht diese Art von tragbarem Gerät die Durchführung des gesamten Protokolls (Probenahme, Vorverarbeitung, Amplifikation und Offenbarung) vor Ort [32]. Wir sollten ein anderes tragbares Gerät für Länder mit niedrigem Einkommen verwenden, in denen die Verwendung des Genie III ein finanzielles Hindernis darstellen könnte. Die globale COVID-19-Pandemie erforderte die Entwicklung mehrerer Tools zur Durchführung kostengünstiger und feldfreundlicher LAMPs [34, 35, 65,66,67]. Es wurde ein kostengünstiges Open-Source-LAMP-Diagnosegerät entwickelt, das eine Echtzeitverstärkung und Fluoreszenzablesung auf die gleiche Weise wie das Genie III ermöglicht [34]. Es wurde sogar nachgewiesen, dass die LAMP-Reaktion mithilfe einer mit Phasenwechselmaterial gefüllten Kaffeekapsel, einem sogenannten „T-Cup“, durchgeführt werden kann, was eine Inkubation bei 63 °C in kochendem Wasser und eine Entdeckung mit bloßem Auge ermöglicht [35]. In einer anderen Studie konnte der Offenbarungsschritt einer Smartphone-basierten LAMP mit einer Smartphone-Anwendung bewertet werden, die mit Filtern gekoppelt ist, die die Fluoreszenzablesung ermöglichen. Zukünftig soll der aktuelle LAMP-Test mit gefriergetrockneten Reagenzien und einem solchen Gerätetyp verbessert und dann an einer großen Stichprobe getestet werden.

In dieser Studie haben wir einen vollständig feldfreundlichen LAMP-Assay entwickelt, der das Vorhandensein der DNA des Trematoden-Zwischenschneckenwirts B. truncatus in der Umwelt nachweist. Aufgrund der Vorteile von LAMP, da es feldfreundlich ist und kostengünstige Proben vor dem Prozess ermöglicht, kann der Bt-eLAMP-Test ein wertvolles neues Werkzeug für die schnelle und effiziente Erstellung wiederkehrender Risikokarten für urogenitale Bilharziose sein. eLAMP wurde auch zum Nachweis des Vorhandenseins von Darmparasiten im Abwasser während der Behandlung eingesetzt und bietet sogar die Möglichkeit, nach Schistosoma sp. zu suchen. eDNA direkt [68]. Es wäre notwendig, eLAMP für andere Bulinus- oder Biomphalaria-Arten zu entwickeln, die für die Übertragung von Schistosoma verantwortlich sind. eLAMP könnte auch für andere SBDs entwickelt werden, die den gleichen diagnostischen Belastungen wie Bilharziose unterliegen.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten.

Durch Schnecken übertragene Krankheit

Schleifenvermittelte isotherme Verstärkung

Umweltschleifenvermittelte isotherme Verstärkung

Polymerase Kettenreaktion

Quantitative Polymerase-Kettenreaktion

Digitale Tröpfchen-Polymerase-Kettenreaktion

Umwelt-DNA

Nachweisgrenze

Positive Kontrolle

Negativkontrolle

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Referenzen herunterladen

Besonderer Dank geht an Alassane Ndiaye, der bei der Sammlung der Umwelt-DNA-Proben vor Ort geholfen hat. Wir danken Celia Robin, die während ihres Praktikums an dem Projekt mitgearbeitet und die zusätzlichen LOOP-Primer entworfen hat.

Diese Studie wurde von der französischen Agentur für Lebensmittel-, Umwelt- und Arbeitsschutz (PNRES 2019/1/059 Molrisk) und der Region Okzitanien (Schistodiag-Programm) finanziert. Diese Studie wurde mit Unterstützung von LabEx CeMEB, einem ANR-Programm „Investissements d'avenir“ (ANR-10-LABX-04-01), und im Rahmen des „Laboratoires d'Excellences (LABEX)“ TULIP durchgeführt ( ANR-10LABX-41).

Hosts Pathogens Environment Interactions, UMR 5244, CNRS, IFREMER, UM, Universität Perpignan, Via Domitia, 66860, Perpignan, Frankreich

Manon Blin, Jérôme Boissier, Stephen Mulero und Olivier Rey

SAS ParaDev®, 66860, Perpignan, Frankreich

Manon Blin und Julien Portela

VITROME, IRD-UCAD International Campus, 1386, Dakar, Senegal

Bruno Senghor

Univ. Grenoble-Alpes, Univ. Savoie Mont Blanc, CNRS-LECA, 38000, Grenoble, Frankreich

Stephen Mulero

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JP, JB, OR und MB konzipierten die ursprüngliche Idee und gestalteten die Studie. MB führte die Laborentwicklung des Bt-eLAMP-Assays durch. JB, BS und MB führten die Feldbeprobung durch. JB und BS stellten malakologisches Fachwissen zur Verfügung. SM stellte die eDNA-Bank zur Verfügung. JB, JP und MB analysierten und interpretierten die Daten. JB und MB haben das Manuskript verfasst. BS, JB, SM, OR, JP und MB haben das Manuskript überarbeitet. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Manon Blin oder Julien Portela.

Unzutreffend.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

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Ausrichtung der Bt-eLAMP-Primer an den ITS2-Marker (Zugangsnummer: MG757890). Jeder Pfeil stellt eine Grundierung dar. Die grünen Farbtöne stellen die Richtung der Primer-Hybridisierung dar (dunkelgrün: vorwärts; hellgrün: rückwärts).

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Nachdrucke und Genehmigungen

Blin, M., Senghor, B., Boissier, J. et al. Entwicklung eines eLAMP-Diagnosetools (Environmental Loop-mediated Isothermal Amplification) für die Felderkennung von Bulinus truncatus. Parasiten Vektoren 16, 78 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05705-4

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Eingegangen: 24. November 2022

Angenommen: 15. Februar 2023

Veröffentlicht: 28. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05705-4

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