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May 21, 2023

Anatomische Schäden durch Bacillus thuringiensis der Sorte israelensis bei Larven der Gelbfiebermücke Aedes aegypti (L.), entdeckt durch Mikro

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 8759 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Mit Techniken der Mikrocomputertomographie und unter Verwendung des Phasenkontrast-Phasenabrufalgorithmus über eine Distanz haben wir verbesserte gerenderte Bilder von Weichgeweben von Aedes aeqypti-Larven im vierten Larvenstadium nach Bti-Behandlung rekonstruiert. Im Gegensatz zu früheren Veröffentlichungen, die auf konventioneller Mikroskopie, entweder optischer oder Elektronenmikroskopie, basierten und sich auf Teilstudien, meist in Form von histologischen Schnitten, beschränkten, zeigen wir hier zum ersten Mal die Auswirkungen von Bti auf die gesamte innere Anatomie eines Insekts . Mithilfe von 3D-gerenderten Bildern konnte die Wirkung des Bakteriums in Geweben und Organen nicht nur abschnittsweise, sondern auch im Ganzen untersucht werden. Wir verglichen die Anatomie gesunder Larven mit den Veränderungen, die bei Larven nach der Exposition gegenüber Bti (für 30 Minuten, 1 Stunde und 6 Stunden) eintraten, und beobachteten den fortschreitenden Schaden, den Bti verursacht. Es wurde eine Schädigung des Mitteldarmepithels bestätigt, wobei es zu einer fortschreitenden Schwellung der Enterozyten, einer Verdickung des Epithels, einer Vergrößerung der Vakuolenräume und schließlich zur Zelllyse kam, wodurch Öffnungen in den Mitteldarmwänden entstanden. Gleichzeitig veränderten die Larven ihre Beweglichkeit, was es ihnen erschwerte, an die Oberfläche zu gelangen und den Atemsiphon richtig zu positionieren, um die Oberflächenspannung zu durchbrechen und zu atmen. Im Inneren wurden osmotische Schockphänomene beobachtet, die zu einer Verformung der Querschnittsform führten, was zu einem weiten Innenraum zwischen der Kutikula und den inneren Strukturen und einem fortschreitenden Zusammenbruch der Trachealstämme führte. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse auf den Tod der Larven hin, und zwar nicht durch Verhungern als Folge der Zerstörung der Epithelien des Verdauungstrakts, wie bereits erwähnt, sondern aufgrund eines synergetischen, katastrophalen Multifaktorprozesses zusätzlich zur Erstickung aufgrund eines Mangels an ausreichender Nahrung Gasaustausch.

Bacillus thuringiensis (Bt) wurde erstmals 1901 von Shigetane Ishiwata entdeckt, der ein Bakterium aus toten Seidenraupenlarven isolierte, als er die Ursache der sogenannten „Sotto-Krankheit“ (Plötzlicher Kollaps-Krankheit) untersuchte. Er nannte das Bakterium Bacillus sotto1. Einige Jahre später isolierte Ernst Berliner einen verwandten Stamm aus toten mediterranen Mehlmottenlarven, die in einer Getreidemühle in Thüringen gefunden wurden, und benannte das Bakterium daraufhin passenderweise B. thuringiensis. Dieser Autor beobachtete auch, dass eine Lösung aus kristallisierten Bt-Toxinen gegen bestimmte Pflanzenschädlinge hochwirksam war2,3,4.

Bt ist ein grampositives sporenbildendes Bakterium, das auf der ganzen Welt und in allen getesteten Ökosystemen vorkommt5. Während der Sporulation synthetisieren Bt-Stämme kristalline (Cry) und zytolytische (Cyt) Proteintoxine, sogenannte δ-Endotoxine, als parasporale Körper, die für viele Insekten giftig sind6,7. Es hat sich gezeigt, dass, wenn Insektenlarven diese Proteinkristalle aufnehmen, sie durch die alkalische Umgebung des Mitteldarms gelöst werden und Protoxine durch die Verdauungsenzyme aktiviert werden, die Poren in der Zellmembran des Verdauungstrakts verursachen, mit tödlichen Folgen für die Insekten, d. h : Ref. 8,9.

Die erste kommerzielle Produktion von Bt als Insektizid wurde 1938 in Frankreich gemeldet und unter dem Namen „Sporéine“ verkauft. Seitdem hat seine Verwendung bei der Entwicklung fortschrittlicher Produkte kontinuierlich zugenommen10. Angus war der erste, der anhand von Seidenraupenlarven (Bombyx mori) und einem Stamm der Bt-Unterart Sotto bewies, dass das Cry-Toxin das wichtigste insektizide Mittel war11, und anschließend wurde nachgewiesen, dass das Darmepithel der Wirkungsort des δ war -Endotoxine12. Heutzutage wurden die Cry-Proteine ​​getestet, um verschiedene Arten unterschiedlicher Insektenordnungen und einige andere Wirbellose wie Milben und Nematoden anzugreifen13. Obwohl seit langem umstritten ist, ob durch die wahllose Freisetzung von Bt in der Natur das Risiko langfristiger Auswirkungen auf Ökosysteme besteht14,15,16, gelten Bt-Produkte aufgrund ihrer Spezifität und biologischen Abbaubarkeit als weitaus bessere Alternative zu chemischen Insektiziden .

Seit der Isolierung der Bt-Sorte israelensis (Bti), deren Parasporen eine starke pathogene Wirkung auf Mückenlarven14,15 (neben Kriebelmücken- und Chironomidenlarven) haben, hat ihr Einsatz zur Mückenbekämpfung und die Anzahl der Veröffentlichungen exponentiell zugenommen16 .

Obwohl es zahlreiche Studien zu den Mechanismen gibt, die seine biozide Wirkung ermöglichen, haben nur wenige Studien anatomisch-histologische Schäden gezeigt17. Dennoch wurde über die Histopathologie des Mitteldarms und die Pathogenese von Bti-Toxinen für mehrere Arten von Culicidae-Mückenlarven berichtet18,19,20,21,22,23,24,25,26, einschließlich der Gelbfiebermücke19,20,21,27,28 .

Um die durch Bti verursachten Schäden beurteilen zu können, ist ein Vergleich mit der Anatomie gesunder Larven wichtig. Es gibt mehrere Studien zu diesem Thema, angefangen mit der klassischen Studie zur Mückenanatomie von Snodgrass29 und der außergewöhnlichen Zusammenstellung von Christophers30 sowie einer aktuellen Studie mit einer histologischen Charakterisierung des Mitteldarms gesunder A. aegypti-Larven31.

Nach der Isolierung15 und Charakterisierung eines Bt-Stammes, dessen parasporale Einschlüsse eine starke pathogene Kraft für Culicidae-Larven aufwiesen14, begannen zytologische Studien zu den histopathologischen Wirkungen von Bti bei A. aegypti18,19. Die bahnbrechende Arbeit von Charles, zunächst mit optischer Mikroskopie19 und dann mit Transmissionselektronenmikroskopie20, war die erste, die die durch Bti verursachten Schäden auf Gewebeebene, hauptsächlich im Verdauungstrakt, nachwies.

Im Gegensatz zu früheren Veröffentlichungen, die auf konventioneller Mikroskopie, entweder optischer oder Elektronenmikroskopie, basierten und sich auf Teilstudien, meist in Form von histologischen Schnitten, beschränkten, war es in dieser Arbeit und dank Mikro-CT möglich, das Innere zu zeigen Anatomie eines Bt-behandelten Insekts erstmals vollständig. Mithilfe von 3D-gerenderten Bildern war es möglich, nicht nur die Strukturen in Abschnitten, sondern auch als Ganzes zu untersuchen und durch den Vergleich der Anatomie gesunder Larven und der Veränderungen, die nach 30-minütiger, 1-stündiger und 6-stündiger Bti-Exposition eintraten, die progressive Entwicklung Schäden, die das Bti verursacht, wurden beschrieben.

Der in dieser Arbeit verwendete Bakterienstamm war B. thuringiensis var. israelensis 4Q5 (Bti 4Q5), vom Bacillus Genetic Stock Center an der Ohio State University. Bti 4Q5 wurde in 50 ml T3-Medium32 bei 30 °C und unter aeroben Bedingungen (200 U/min) 72 Stunden lang kultiviert, bis eine vollständige Sporulation beobachtet wurde (107 Sporen/ml). Die Kultur wurde 20 Minuten lang bei 4000 g zentrifugiert, und das Pellet wurde dreimal gewaschen und in 5 ml Milli-Q-Wasser (22 mg Sporenkristallsuspension/ml) resuspendiert. Die erhaltene Sporen- und Kristallsuspension wurde bis zur Verwendung bei 4 °C aufbewahrt.

Nach der Ankunft wurden die Eier in einen Glasbehälter mit entchlortem Leitungswasser und gemahlenem handelsüblichem Trockenfutter für Katzen gelegt. Der Behälter wurde in einem Insektenraum inkubiert (25 °C ± 2 °C, 65 % Luftfeuchtigkeit und eine Photoperiode von 16 h:8 h Licht:Dunkel). Unter diesen Bedingungen schlüpften die Eier innerhalb von zwei Tagen. Katzenfutter wurde bei Bedarf bereitgestellt. Für den Biotest mit Bti 4Q5 wurden Larven von Aedes aegypti im frühen vierten Stadium verwendet. Die verbleibenden Larven, die nicht im Bioassay verwendet wurden, wurden durch Zugabe von Bleichmittel in den Aufzuchtbehälter getötet.

Zehn A. aegypti-Larven wurden in ein 30-ml-Kunststoffröhrchen mit 10 ml entchlortem Leitungswasser und trockenem Katzenfutter gegeben und unter den gleichen Bedingungen wie zuvor beschrieben im Insektenraum gehalten. Den Larven wurden einhundert Mikroliter der zuvor beschriebenen Sporen- und Kristallsuspension von Bti 4Q5 zugesetzt. Zwei Larven wurden zu unterschiedlichen Zeiten (30 Minuten, 1 Stunde und 6 Stunden) mit einer Kunststoff-Pasteurpipette entnommen und in Kunststoffröhrchen mit 5 ml 70 %igem Ethanol gegeben. Nach Ablauf der Zeit wurden die Larven wie unten beschrieben fixiert und für die Mikrotomographie behandelt. Die 30-minütigen Larven waren am Leben und die Larven, die 1 Stunde und 6 Stunden nach Beginn des Bioassays entnommen wurden, waren tot.

Für die mikrotomographische Untersuchung wurden aus jedem Bioassay zwei bereits in 70 % Ethanol konservierte Larven mit steigenden Bti-Einwirkungszeiten entnommen und mit steigenden Ethanolkonzentrationen (80 %, 90 %, 100 %) jeweils 30 Minuten lang bei Raumtemperatur dehydriert. Vor dem Scannen wurden die Larven 24 Stunden lang in einer Lösung von 1 % Jod in absolutem 100 % Ethanol gefärbt, 12 Stunden lang in Hexamethyldisilazan (HMDS) getaucht und über Nacht an der Luft getrocknet. Die Proben wurden entweder in ein 0,2-ml-Eppendorf-Röhrchen gescannt (das mit Plastilin am Probenhalter befestigt war) und die Larven darin mit Basotect® [Melaminharzschaum, hergestellt vom Chemieunternehmen BASF] fixiert, einem Material, das sich leicht digital entfernen lässt33 [Abb. 1a]) oder mit Cyanacrylat an die Spitze einer Nylon-Angelschnur (200 µm Durchmesser) geklebt und mit einem Plastikstrohhalm abgedeckt, um jede durch den Luftkühlstrom während des Scanvorgangs verursachte Bewegung zu vermeiden (Abb. 1b). Es wurde ein hochauflösender Desktop-Mikrotomograph SkyScan 1172 verwendet, der mit einer Hamamatsu L702 (100/250)-Quelle und einer Ximea 11-MP-Kamera aufgerüstet wurde. Die Scanparameter wurden wie folgt eingestellt: Isotrope Voxelgröße = 0,54 µm; Quellenspannung = 48 kV, Quellenstrom = 49 µA, Bildrotationsschritt = 0,53° (0,2 für die 6-Stunden-Larven), 180°-Rotationsscan und kein Filter. Um die gesamte Länge der Larven erfassen zu können, mussten 5–7 zusammenhängende Übergrößenscans durchgeführt werden. Die resultierenden TIFF-Bilder wurden mit der aktuellen NRecon-Software von Bruker micro-CT (v.2.0.0.5) unter Verwendung des von David Paganin et al.34 beschriebenen Single-Distance-Phase-Retrieval-Algorithmus rekonstruiert, der phasenkontrastrekonstruierte, verbesserte Bilder von Weichteilen ermöglicht .

Mikro-CT-3D-gerenderte Bilder mit Sagittalschnitten von A. aegypti-Larven im vierten Stadium. Bereit zum Scannen montierte Proben (a,b) und mit Ethanol konservierte Larven (c–e). Verformung (d) nach Exposition gegenüber B. thurigiensis var. israelensis (Bti) und erstellter leerer Raum, markiert mit roten Pfeilen (e). Kontrollieren Sie gesunde Larven (c,f,g). Larven nach unterschiedlichen Expositionszeiten gegenüber Bti (d,e,h–k): 30 min (d,e,h), 1 h (i,j), 6 h (k). Details des vorderen Mitteldarmepithels und der umgebenden Muskeln (g,i). Beachten Sie die Verformung (d) und den entstandenen Leerraum (e) sowie den durch Bti verursachten fortschreitenden Zelllyseeffekt, der in Form von Öffnungen im Mitteldarmepithel beobachtet wird. Die Bauchsegmente sind nummeriert. Fd-Nahrung, Fme vordere Mitteldarmepithelien, Gc Magen-Caeca, Mu-Muskeln, Op-Mitteldarmepithelöffnungen, Pm peritrophe Membran.

Für den primären „Reinigungsprozess“ wurde die Skyscan-Software CTAnalyser v.1.20.8.0 des Bruker-Mikro-CT verwendet. Die resultierenden Bilder wurden mit DataViewer v.1.6.0.0 neu ausgerichtet (wird verwendet, um geschnittene gerenderte Bilder der Abb. 3 und 4 zu erhalten), und CTvox v.3.3.1 wurde verwendet, um 3D-gerenderte Bilder der Abb. 3 und 4 zu erhalten. 1f–k und 2 und das Zusatzvideo S1, wie zuvor beschrieben35.

Mikro-CT-3D-gerenderte Bilder mit Sagittalschnitten von A. aegypti-Larven im vierten Stadium, die die innere Anatomie zeigen, um die äußere Oberfläche der Epithelien des Verdauungstrakts sichtbar zu machen. Kontrollieren Sie gesunde Larven (a) und Larven nach 1-stündiger Exposition gegenüber Bti (b). Beachten Sie in b die durch das Bti verursachten Schäden, die sich in Form von entstandenen Öffnungen und Leerräumen bemerkbar machen.

Die gerenderten Mikro-CT-Bilder der Larven zeigen die wichtigsten anatomischen Strukturen und Organe (Abb. 1f – k und 2 sowie Zusatzvideo S1). So werden neben den äußeren Strukturen von Kopf, Brustkorb und Bauch auch die inneren anatomischen Details detailliert dargestellt, mit dem Gehirn, den Muskeln, den Fettkörpern und dem Verdauungstrakt (Mundöffnung, Rachen, Speiseröhre, Proventriculus, Magen). Blinddarm, Mitteldarm, Rektum und die Lage der Analöffnung). Im Inneren des Verdauungstraktes sind die umgebende peritrophe Membran und die Epithelschicht zu erkennen. Darüber hinaus sind die Speicheldrüsen, die Malpighischen Tubuli (Abb. 1f, h, j; 2, 3 und 4) und die Imaginalscheiben der Beine (Abb. 2b, 3c) deutlich zu erkennen.

Mikro-CT-Schnittbilder mit sagittalen Schnitten von A. aegypti-Larven im vierten Stadium, vergleichbar mit denen, die in der Literatur unter Verwendung histologischer Mikroskopietechniken erhalten wurden, zeigen die innere Anatomie. Kontrollieren Sie gesunde Larven (a). Larven nach unterschiedlichen Expositionszeiten gegenüber Bti (b–d): 30 min (b), 1 h (c) und 6 h (d). Beachten Sie den entstehenden leeren Raum und den durch Bti verursachten Zelllyseeffekt, der sich in Form von Öffnungen in den Mitteldarmepithelien, einer Zunahme der Vakuolen und einer fortschreitenden Schwellung der Mitteldarmzellepithelien, die sich in Form einer Zunahme der Dicke bemerkbar macht, bemerkbar macht. Fd-Nahrung, Fme vordere Mitteldarmepithelien, Gc Magen-Caeca, Mu-Muskeln, Op-Mitteldarmepithelöffnungen, Pm peritrophe Membran, Vc-Vakuolen.

Mikro-CT-Schnittbilder mit Querschnitten von A. aegypti-Larven im vierten Stadium auf Höhe des dritten (a,c,e) und fünften Abdomensegments (b,d,f,g). Kontrollieren Sie gesunde Larven (a,b). Larven nach unterschiedlichen Expositionszeiten gegenüber Bti (c–g): 30 min (c,d), 1 h (e,f) und 6 h (g). Beachten Sie den erzeugten leeren Raum und den durch Bti verursachten Zelllyseeffekt, der in Form von Öffnungen in den Mitteldarmepithelien, einer Zunahme der Vakuolen, einer fortschreitenden Schwellung der Mitteldarmzellepithelien (beobachtet als Dickenzunahme) und einer fortschreitenden Schwellung der Mitteldarmzellepithelien beobachtet wird Zusammenbruch der Trachealstämme.

Nach der Exposition gegenüber Bti wurden die Larven weniger aktiv und verhielten sich unberechenbar, mit immer langsameren Bewegungen, selteneren Fahrten zur Oberfläche zur Sauerstoffaufnahme und schließlich zum Tod. Während dieses Prozesses werden die Larven zunehmend weicher und schlaffer. Im Vergleich zu Kontrolllarven (Abb. 1c, f, 2a, 3a, 4a, b) kam es je nach Zeitpunkt der Bti-Exposition zu einer fortschreitenden Verformung und es wurden auffällige Leerräume zwischen der Kutikula und den inneren Strukturen beobachtet. Diese Veränderungen sind unter einem stereoskopischen Binokularmikroskop sichtbar (Abb. 1d, e) und werden in gerenderten Mikro-CT-Bildern deutlich dargestellt (Abb. 1h, j, 2b, 3b, c, 4c–f). Darüber hinaus wird im Querschnitt deutlich, dass im Vergleich zu den unbehandelten Larven, die einen flachen ventralen Teil haben (Abb. 4a, b), der Schnitt nach der Exposition gegenüber Bti nahezu kreisförmig wird (Abb. 4e, f). . Parallel dazu wird im Vergleich zu Kontrolllarven (Abb. 1c, f, g, 2a, 3a, 4a, b) der durch Bti verursachte fortschreitende Zelllyseeffekt in Form einer Zunahme der Vakuolen und einer fortschreitenden Schwellung der Mitteldarmzellepithelien beobachtet , bei dem eine Zunahme der Dicke zusammen mit ausgedehnten Öffnungen in den Wänden des Mitteldarms beobachtet werden kann (Abb. 1i–k). Diese Öffnungen sind in den 3D-gerenderten Bildern zu erkennen, in denen die äußere Oberfläche des Mitteldarmepithels als sehr auffällige Querschlitze des Mitteldarms rekonstruiert wurde (Abb. 2b), sowie in den Querschnitten der gerenderten Bilder (Abb. 3c, d, 4c–g). Zusätzlich zu diesen Öffnungen sind Vakuolen in den Epithelzellen des Mitteldarms sichtbar (Abb. 3d, 4f, g). Darüber hinaus kollabieren die dorsalen Trachealstämme zunehmend von einem regelmäßigen länglichen Abschnitt (Abb. 4a, b), wodurch ihre Lumina verringert wird (Abb. 4e, f), bis sie fast nicht mehr zu unterscheiden sind (Abb. 4g). Nach 6 Stunden Bti-Exposition war der Abbau maximal und die Larven zeigten stark degradierte Mitteldarmepithelwände, eine Zunahme des Zellvolumens mit Vakuolen und Öffnungen sowie vollständig kollabierte Trachealstämme (Abb. 1k, 3d, 4e–g).

Über die hier beobachtete Wirkung von Bti auf die Larvenbewegung wurde bereits bei Aedes albopictus26 und A. aegypti36 berichtet.

Die in dieser Arbeit gezeigten mikro-CT-gerenderten 3D-Bilder sind vergleichbar mit denen, die mit klassischen anatomischen Methoden erhalten wurden33. Somit ermöglichen die 3D-gerenderten Bilder, die wir von A. aegypti erhalten haben, die Identifizierung anatomischer Strukturen und Organe, die zuvor für Culicidae-Mücken in klassischen Werken wie denen von Snodgrass29 oder Christophers30 sowie in neueren Werken19,20,21,26,31 beschrieben wurden. 37,38,39. Sogar die in diesen früheren Arbeiten gezeigten histologischen Bilder sind mit den in den Abbildungen gezeigten Mikro-CT-gerenderten Bildern vergleichbar. 3 und 4. Darüber hinaus ist die Qualität der gerenderten Mikro-CT-Bilder weitaus besser als die, die mit Techniken der optischen Kohärenztomographie erhalten wurden, die kürzlich zur Untersuchung von Mücken eingesetzt wurden40. Wir haben zuvor Mikro-CT verwendet, um die Anatomie verschiedener Insekten zu beschreiben33,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57, aber dies Soweit uns bekannt ist, ist es das erste Mal, dass diese Technologie verwendet wurde, um die Auswirkungen eines Krankheitserregers auf seinen Wirt zu untersuchen.

Ein ähnlicher Abbau der Mitteldarmepithelien, der in dieser Arbeit beobachtet wurde, wurde häufig bei anderen Dipteren, insbesondere bei Culicidae-Mücken, nach Exposition gegenüber Bti-Toxinen berichtet18,19,20,22,23,24,25,26,28,37,39. Tatsächlich wurde der erste histologische Nachweis einer durch Bti bei A. aegypti verursachten histopathologischen Schädigung von Charles und Barjac19,20 veröffentlicht, die feststellten und beschrieben, wie bei den ersten Anzeichen die schnellste Entwicklung im Mitteldarm stattfindet. Sie beobachteten, dass es 25 Minuten nach der Zugabe des Toxins vollständig lysiert war, wohingegen die Zellen in den nachfolgenden Bereichen zu diesem Zeitpunkt deutlich weniger verändert waren. Die Zellen des Proventriculus schienen keinerlei Veränderungen zu erfahren, und die peritrophische Membran sonderte weiterhin ohne erkennbare Veränderung ab. Lüthy & Wolfersberger28 berichteten, dass intrazelluläre histopathologische Veränderungen sehr schnell innerhalb eines Zeitrahmens von fünf bis zehn Minuten ablaufen. Diese stimmen voll und ganz mit unseren Beobachtungen überein, da wir 30 Minuten nach der Bti-Exposition eine Lyse der Epithelwände des Mitteldarms beobachteten, die deutlich als auffällige Öffnungen sichtbar war. Darüber hinaus beschrieb Clark37, dass die Epithelzellen nach Bti-Exposition einen degradierten Aspekt mit zytoplasmatischer Extraktion, einer Zunahme des Zellvolumens, sekretorischen Vesikeln und Vakuolen aufweisen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Schaden aus Löchern und Blasen in der Membran mit Ablösung von Zellen bestand, was vollständig mit dem übereinstimmt, was wir durch Mikro-CT nach fortschreitender Bti-Exposition beobachtet haben.

Sowohl die von Bt produzierten Cry- als auch Cyt-Proteinfamilien wirken gegen Insekten unterschiedlicher Ordnung, indem sie Membranen verändern. Insbesondere interagieren Cyt-Toxine direkt mit Membranlipiden6 und beeinflussen die Membranpermeabilität in Insektenzelllinien, während Cry-Toxine Zellen abtöten, indem sie nach der Rezeptorerkennung und -bindung Poren bilden, was zum Zelltod durch kolloidosmotische Lyse führt28,58. In unserer Studie haben wir die kombinierte Wirkung beider Arten von Toxinen beobachtet, da Bti 4Q5 drei Cry-Toxine (Cry4Aa, Cry4Ba und Cry11Aa) und ein Cyt-Protein (Cyt1Aa) produziert und möglicherweise Cyt2Ba, Cry1Ca und Cry10Aa59 produziert.

Aus makroskopischer Sicht führen Veränderungen im Mitteldarm nach Bti-Exposition zu einem osmotischen Schock und einer Ansammlung von Wasser im Larvenkörper, wodurch ein leerer Raum zwischen der Kutikula und den inneren Strukturen entsteht und die beobachtete Verformung des Abdomens auftritt, die annähernd kreisförmig wird im Abschnitt.

Unabhängig von den Mechanismen, die in den letzten Jahren als unterschiedliche Modelle für Lyse und Zelltod postuliert wurden, gelten derzeit Schäden durch den Abbau der Epithelwände des Verdauungstrakts als Hauptursache für das Absterben der Larven. Daher wurde traditionell davon ausgegangen, dass diese Zerstörung des Darms zu einer schnellen Einstellung der Nahrungsaufnahme und dem anschließenden Tod des Insekts durch Inanition führt59. Zumindest in Ae. Im Fall von Agypti konnten Darmstörungen und Bewegungslosigkeit nicht in so kurzer Zeit zum Tod führen. Darüber hinaus wird die Darmmembran zerstört, da durch die Freisetzung alkalischer Magensäfte in die Hämolymphe der pH-Wert verändert und diese alkalisiert wird. Bei Insekten haben diese Veränderungen nachweislich die Funktion des Nervensystems beeinträchtigt und sogar Lähmungen hervorgerufen60. Dies deckt sich mit unseren Beobachtungen. Der Zusammenbruch von Zellen und die daraus resultierende Schädigung von Organen, Veränderungen des Nervensystems, die die Bewegungen beeinflussen, und in extremen Fällen Lähmungen beeinträchtigen sicherlich die normalen Bewegungen der Larven in Richtung Wasseroberfläche und die richtige Positionierung des Atemsiphons für den Gasaustausch. Darüber hinaus würde der Kollaps der Luftröhrenstämme, der erstmals in dieser Studie beobachtet wurde, aufgrund einer Synergie von Faktoren, einschließlich Schwierigkeiten beim korrekten Gasaustausch, sicherlich den Tod bedeuten.

Der Einsatz der Mikro-CT-Technik ermöglichte es uns, eine vollständige Rekonstruktion der Anatomie von Larven im vierten Larvenstadium der Gelbfiebermückenart A. aegypti durchzuführen, die tatsächliche Position interner Strukturen und Organe zu lokalisieren und interne anatomische Strukturen gesunder Larven mit denen zu vergleichen andere nach verschiedenen Expositionszeiten gegenüber Bti und Vergleich der Schadensnachweise. Wir bieten auch detaillierte 3D-Mikro-CT-gerenderte Bilder und das Zusatzvideo S1 an. Diese Arbeit stellt die erste vollständige Mikro-CT-Rekonstruktion der inneren Anatomie von Larven im vierten Larvenstadium von A. aegypti dar und zeigt die durch die Wirkung von Bti verursachten Schäden, wie z. B. die Verdickung der Epithelzellen des Mitteldarms (Enterozyten), das Erscheinungsbild Bläschen (Vakuolen) und die Trennung der Zellen, wodurch die Öffnungen (Löcher und Schlitze) entstehen, die wenige Minuten nach der Bti-Exposition im Mitteldarm entstehen. Diese Ergebnisse stimmten mit den Phänomenen überein, die erstmals anhand histologischer Schnitte auf Objektträgern beschrieben und veranschaulicht wurden. Mithilfe der Mikro-CT konnten wir jedoch qualitativ hochwertige gerenderte Bilder von Details der Larven erhalten, die zum Teil denen entsprechen, die zuvor durch optische Mikroskopie erhalten wurden. Wir konnten jedoch die gesamten Tiere anstelle von Teilen der Larven in völlig neuer Form sehen Perspektiven der 3D-Strukturen innerhalb der gesamten Proben.

Die Zelllyse verändert verschiedene Gewebe und Organe, wobei sich wahrscheinlich der pH-Wert der Hämolymphe durch die Freisetzung von Magensäften aus dem Darm ändert. Dies würde die normale Funktion des Nervensystems beeinträchtigen und die bereits bekannte Wirkung auf die Motilität der Larven haben. Dies würde es den Larven erschweren, die Wasseroberfläche zu erreichen und den Atemsiphon richtig zu positionieren, um die Oberflächenspannung des Wassers zu durchbrechen. Diese Faktoren, zusammen mit der Tatsache, dass Mikro-CT gezeigt hat, dass Bti einen osmotischen Schock hervorruft, wodurch ausgedehnter leerer Raum entsteht und die dorsalen Trachealstämme kollabieren, würden sicherlich den Tod der Larven erklären, und zwar nicht durch Inanition, wie bereits erwähnt, sondern aufgrund synergistischer katastrophaler Multifaktorprozesse. Darüber hinaus würde es aufgrund des fehlenden ausreichenden Gasaustausches zu Erstickung kommen. Der verwendete Ansatz und die hier erzielten Ergebnisse eröffnen neue Perspektiven für die weitere Forschung und beweisen, dass die Mikro-CT eine leistungsstarke Methode darstellt, nicht nur zur Untersuchung der Insektenanatomie, sondern auch zur Untersuchung der pathogenen Wirkung von Entomopathogenen auf Insekten.

Die im Verlauf der Studie generierten und analysierten Datensätze sind bei JA-T erhältlich. auf begründete Anfrage.

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Dieses Papier wurde vom Ministerium für Universität, Forschung und Innovation der Junta de Andalucia (Spanien) und dem FEDER-Programm im Rahmen der Forschungsprojekte finanziert: „Charakterisierung von Varianten von Cry-Toxinen, die gegen die Mittelmeerfruchtfliege (Ceratitis capitata) aktiv sind und durch Proteinphagen gewonnen werden.“ Display-Technologie“ (B-BIO-081-UGR18) und „Suche nach neuen Cry-Toxinen mit Aktivität gegen den Bienenektoparasiten Varroa destructor durch in vitro Proteinevolution und die Phagen-Display-Technik Proteine ​​in Phagen“ (A-BIO-424-UGR20) , geleitet von Dr. Susana Vilchez. Wir danken den Mitarbeitern von Bruker SkyScan in Kontich (Belgien) für ihre Effektivität und schnelle Unterstützung, für ihre ständige Verbesserung der Software und für die Implementierung der von uns gewünschten neuen Optionen. In dieser Hinsicht sind wir insbesondere Alexander Sasov (jetzt bei NeoScan www.neoscan.com), Stephan Boons, Xuan Liu, Phil Salmon und Vladimir Kharitonov zu Dank verpflichtet. Wir danken Dr. Colin Berry von der University of Cardiff für die Bereitstellung von A. aegypti-Eiern und dem Stamm Bti 4Q5.

Abteilung für Zoologie, Fakultät für Naturwissenschaften, Universität Granada, 18071, Granada, Spanien

Javier Alba-Tercedor

Institut für Biotechnologie und Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie I, Fakultät für Naturwissenschaften, Universität Granada, 18071, Granada, Spanien

Susana Vilchez

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Konzeption und Gestaltung der Experimente: SV Durchführung der Bti-Expositionsexperimente: SV. Probenvorbereitung, Mikro-CT-Scan, Softwareverarbeitung zur Erstellung gerenderter Bilder, Abbildungstafeln und ergänzende Videovorbereitung: JA-T. Analyse und Interpretation der Ergebnisse: JA-T., SV Verfasser der Arbeit: JA-T., SV

Korrespondenz mit Javier Alba-Tercedor oder Susana Vilchez.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Zusatzvideo 1.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Alba-Tercedor, J., Vilchez, S. Anatomische Schäden durch Bacillus thuringiensis der Sorte israelensis bei Larven der Gelbfiebermücke Aedes aegypti (L.), nachgewiesen durch Mikrocomputertomographie. Sci Rep 13, 8759 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35411-1

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Eingegangen: 13. Januar 2023

Angenommen: 17. Mai 2023

Veröffentlicht: 30. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35411-1

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